基于納米材料構建新型蛋白激酶傳感器.pdf

1、在人類基因組計劃中發(fā)現人體內有超過2000種的激酶，其中編碼蛋白激酶基因的數量超過500種。蛋白激酶催化磷酸化在調節(jié)信號傳導途徑中起重要作用，其涉及大多數重要的胞內過程如細胞生長、新陳代謝、分化、增殖和凋亡。通常情況下，蛋白激酶活性的異常和過表達會引起細胞信號的反常，這些反常的信號又與一系列常見疾病包括癌癥、糖尿病、炎癥、心臟疾病和老年癡呆癥有關聯。因此，檢測蛋白激酶活性不僅對理解這些疾病相關的基礎生化過程很有價值，而且對臨床診斷和藥物

2、研發(fā)有重要作用。
　　 目前檢測蛋白激酶的方法主要基于放射性γ-32/33p-ATP、熒光、電化學、表面等離子共振和質譜等技術。這些方法雖能有效檢測蛋白激酶，但都在某些方面存在各自的不足，如放射性方法由于有害放射性元素的使用而對人類健康和環(huán)境有很大威脅，在一些方法中涉及標記、孵育、封閉、清洗、檢測信號的生成和放大等多步檢測過程，其是非常費時耗力的。因此構建靈活快速、通用和低耗高效的激酶分析方法仍是一個挑戰(zhàn)。
　　 基于上

3、述陳述，查閱相關文獻，本論文利用各種新型納米材料（金納米粒子、石墨烯）的獨特內在性質和肽鏈端解酶的水解性質，構建了三種新穎且快速檢測蛋白激酶的分析傳感平臺。具體如下:
　　 1、我們設計了一種新穎的基于磷酸化阻礙羧肽酶(CPY)水解的比色金納米粒子(AuNPs)/多肽平臺用于檢測蛋白激酶活性和抑制作用。該AuNPs/多肽平臺通過紫外-可見分光計甚至肉眼觀察溶液顏色變化來檢測激酶活性。其能靈敏檢測cAMP依賴型蛋白激酶(PKA)的

4、活性進而證明該方法的可行性，對PKA檢測有較低的檢測限(0.232 mU/μL)，通過H-89來評估激酶抑制作用，其IC50值為18.13 nM。該分析方法還能成功地用于細胞裂解液中激酶活性的檢測。由于其無標記、均相、同源和比色檢測的優(yōu)點，該方法在高通量篩選激酶相關的目標藥物上有巨大的潛能。
　　 2、我們構建了一種新穎且快速的熒光傳感平臺用于監(jiān)測蛋白激酶，其基于氧化石墨烯(GO)的超淬滅能力和適配體多肽(FITC-IP20)的

5、特異識別。在該GO/多肽平臺中，FITC-IP20吸附到GO表面而引起熒光淬滅，由于適配體多肽和活性蛋白激酶(PKA)的特異結合而導致其熒光恢復。其是一個“turn-on”的快速激酶檢測方法（大約10 min）。該方法能靈敏檢測PKA活性，檢測限為0.053 mU/μL。這一分析方法同樣適用于細胞裂解液中激酶活性檢測。此外，該基于GO的分析方法可作為一個通用平臺用于檢測不同的蛋白激酶，只需改變其特定的同源適配體多肽。因此，該構建的方法不

6、僅為蛋白激酶生物傳感提供一項有潛力的技術，而且作為一個令人感興趣的例子拓展了GO在翻譯后修飾酶研究中的應用。
　　 3、我們構建了一種基于氧化石墨烯(GO)/多肽納米復合物和磷酸化阻礙羧肽酶(CPY)水解的生物傳感平臺檢測蛋白激酶活性。激酶催化的磷酸化能抑制CPY消化熒光團標記的多肽探針，形成GO/多肽復合物，進而導致熒光淬滅。然而未磷酸化多肽能被CPY降解從而釋放熒光團，熒光恢復。該基于GO的納米傳感器成功地用于激酶模型PKA