疊氮溴化乙錠(EMA)聯(lián)用PCR方法應用于雞肉中沙門氏菌活菌檢測研究.pdf

1、疊氮溴化乙錠(EMA)是一種核酸熒光染料，它具有與細胞外DNA、死亡細胞DNA或細胞膜受損細胞的DNA共價結合并抑制其發(fā)生PCR擴增反應，而對活菌細胞DNA擴增不產(chǎn)生影響的特點。因此將EMA與PCR技術相結合，可克服直接PCR方法無法區(qū)分死活菌的缺點，并避免假陽性試驗結果。EMA與PCR技術相結合的技術已用于多種致病菌的檢驗，研究發(fā)現(xiàn)添加一定量的EMA不會對副溶血弧菌、腸彎曲桿菌、結合酵母、黏質沙雷氏菌等細菌的DNA擴增產(chǎn)生抑制作用，但

2、會造成大腸桿菌O157∶H7、金黃色葡萄球菌、單增李斯特氏菌、藤黃微球菌和遠緣鏈球菌等細菌基因組DNA提取量不同程度的損失。此外，EMA是否會影響腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌活菌的DNA擴增未見相關報道。因此，本研究將EMA應用于鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌的檢測，探索EMA對腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌活菌DNA擴增的影響情況，建立一種只檢測沙門氏菌活菌的方法。具體研究內容和試驗結果如下:
　　1.腸炎沙門氏菌EMA PCR檢測

3、方法的建立
　　本部分首先探討了EMA對腸炎沙門氏菌DNA擴增的影響情況，然后用于死/活混合菌液的檢測，以建立EMA PCR檢測方法。結果發(fā)現(xiàn):添加EMA至終濃度為50μg/mL、曝光時間為10 min時，可抑制濃度為2.75×107 CFU/mL的腸炎沙門氏菌死菌的DNA擴增，且不會影響PCR方法檢測腸炎沙門氏菌活菌的靈敏度，可有效避免假陽性試驗結果。
　　2.雞肉中活的鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌的EMA RT-PCR檢

4、測方法的建立
　　本部分使用EMA與RT-PCR聯(lián)用的方法研究EMA處理對目標菌PCR反應的影響情況，然后將建立的EMA RT-PCR方法用于雞肉中沙門氏菌的檢測。結果發(fā)現(xiàn):活菌添加EMA至終濃度為50μg/mL時，其Ct值與未經(jīng)EMA處理組的Ct值無顯著性差異(P＞0.05)，死菌經(jīng)EMA處理后其Ct值與活菌經(jīng)EMA處理后的Ct值有顯著性差異(P＜0.05)，而與陰性對照組無顯著性差異(P＞0.05)，表明添加EMA不會影響活菌

5、的DNA擴增。使用鼠傷寒沙門氏菌特異性引物建立的EMA RT-PCR方法用于雞肉中鼠傷寒沙門氏菌的檢測發(fā)現(xiàn)，與直接RT-PCR方法相比，EMA RT-PCR方法的檢測結果更接近與平板計數(shù)結果(P＞0.05)。相應地，使用腸炎沙門氏菌特異性引物建立的EMA RT-PCR方法用于雞肉中腸炎沙門氏菌的檢測其試驗結果也與平板計數(shù)結果無顯著性差異(P＞0.05)。
　　3.雞肉中混合沙門氏菌EMA RT-PCR檢測方法的建立
　　本部

6、分首先建立了沙門氏菌屬通用引物建立了沙門氏菌的EMA RT-PCR檢測方法，然后將其與第二部分建立的兩種方法同時應用于雞肉中混合沙門氏菌的檢測。結果表明，當只添加一種引物進行RT-PCR時，使用通用引物建立的沙門氏菌EMA RT-PCR方法可以較準確地檢出樣品中活的沙門氏菌，其檢測結果與與平板計數(shù)結果差異不顯著(P＞0.05);使用鼠傷寒沙門氏菌特異性引物、腸炎沙門氏菌特異性引物分別建立的EMA RT-PCR方法，其對混合樣品中鼠傷寒沙