環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)肉類(lèi)中的大腸桿菌O157︰H7的研究.pdf

1、國(guó)內(nèi)外檢測(cè)E.coli O157:H7的方法很多，我國(guó)進(jìn)出口食品對(duì)E.coli O157:H7目前采用的方法是以行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SNT0973-2010作為依據(jù)。通過(guò)對(duì)樣品增菌處理后，進(jìn)行平板劃線，然后挑取可疑菌落進(jìn)行形態(tài)、染色及血清學(xué)試驗(yàn)、生化鑒定等進(jìn)行判定。檢測(cè)過(guò)程耗時(shí)長(zhǎng)達(dá)4～7天，難以適應(yīng)快速檢驗(yàn)的要求。本研究針對(duì)E.coli O157:H7,GenBank: S83460.1編碼O157抗原的rfbE基因序列和GenBank:AF228

2、487.1編碼鞭毛H7特異性抗原的fliC基因序列，運(yùn)用在線引物設(shè)計(jì)軟件(https://primerexplorer.jp/lamp3.0.0/index.html)設(shè)計(jì)LAMP引物。對(duì)反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、鎂離子濃度等擴(kuò)增條件進(jìn)行了優(yōu)化。確定25μL的LAMP反應(yīng)體系是：內(nèi)引物（FIP和BIP）各1.6μm，外引物（F3和B3）各0.2μm，環(huán)引物（LF和LB）各0.8μm，2.5 mmol/L dNTP，4 mmol/L MgSO4

3、，10×Bst DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液，8U的Bst DNA聚合酶大片段，3μLDNA模板和用滅菌雙蒸水補(bǔ)足體系。確定LAMP反應(yīng)過(guò)程是首先在63℃水浴鍋中反應(yīng)20min，然后將其放入80℃水浴鍋中，水浴10min終止反應(yīng)，通過(guò)肉眼觀察有無(wú)白色焦磷酸鎂沉淀。此外，取擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5％瓊脂糖凝膠電泳，觀察梯形條帶，以證實(shí)是否發(fā)生了LAMP反應(yīng)。改良LAMP檢測(cè)E.coli O157:H7的純培養(yǎng)物的靈敏度達(dá)到1.4CFU/mL。和人工污

4、染檢出限達(dá)到1.8CFU/g。
　　比較了6種模板制備方法對(duì)LAMP檢測(cè)肉及肉制品中E.coli O157:H7的影響。研究表明LAMP方法對(duì)制備模板DNA的要求不高。采用熱裂解法提取DNA，不僅提取時(shí)間將大大減少，而且也將大大降低檢測(cè)成本。對(duì)187份實(shí)際樣品同時(shí)進(jìn)行改良LAMP檢測(cè)和依據(jù)SNT0973-2010進(jìn)行常規(guī)檢測(cè)，結(jié)果證明，兩種方法符合率達(dá)到99.47%。
　　研究表明LAMP快速檢測(cè)E.coli O157:H7