原料乳中兩種病原菌雙重PCR檢測方法的建立與應用.pdf

1、近年來，隨著乳制品行業(yè)規(guī)模化生產的快速發(fā)展，由乳及乳制品的安全問題所引發(fā)的乳源性疾病，特別是細菌性食物中毒事件時有發(fā)生。因此，對乳源性病原菌的檢測研究受到了前所未有的重視。大量研究結果表明金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和致病性大腸桿菌(pathogenic Escherichia coli)是污染原料乳的兩種最常見的人畜共患病病原菌，它們通過引發(fā)乳及乳制品的腐敗變質，進而導致人畜共患病和人類食物中毒的發(fā)生。

2、為此，加強原料乳及乳制品中金黃色葡萄球菌和致病性大腸桿菌的檢測對預防和控制乳源性疾病的發(fā)生和流行顯得至關重要。本研究在建立可同步檢測金黃色葡萄球菌和致病性大腸桿菌的雙重PCR方法的基礎上，對合肥地區(qū)采集的新鮮原料乳以及市售乳制品進行上述兩種病原菌檢測，以期探明原料乳及乳制品的污染狀況。
　　 首先，建立了檢測金黃色葡萄球菌和致病性大腸桿菌的單一PCR方法。選取金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶nuc基因和致病性大腸桿菌粘附素K99基因作為

3、檢測目的基因，根據nuc基因和K99基因的保守區(qū)序列，應用Primer5.0軟件設計合成2對特異性引物。在其他因素不變的條件下，通過對引物濃度、模板濃度、退火溫度和Mg2+濃度的摸索，確定了金黃色葡萄球菌單一PCR檢測方法的最佳條件是：在25μL反應體系中加入10×PCRBuffer2.5μL，dNTPs0.5μL，Mg2+(25mM)1.5μL，DNA模板3.0μL，引物(20 pmol)各0.5μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL

4、)0.3μL，雙蒸水16.2μL。各成分混合后進行95℃預變性10min，94 ℃變性45s；58 ℃退火30s；72 ℃延伸30s，共循環(huán)30次，最后72 ℃后延伸5min。致病性大腸桿菌單一PCR檢測方法的最佳條件是將退火溫度降至56 ℃，其余條件同上。
　　 其次，建立了可同時檢測金黃色葡萄球菌和致病性大腸桿菌的雙重PCR方法。在單一PCR檢測方法的基礎上，采用正交試驗對引物濃度、Mg2+濃度、模板濃度和退火溫度在4個水平

5、上進行L16（44）優(yōu)化試驗，確定了雙重PCR方法的最佳條件為：25μL反應體系中，10×PCRBuffer 2.5μL，dNTPs 0.5μL，Mg2+(25mM)2.5μL，DNA模板終濃度比為1:1、引物終濃度比為1:3，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.3μL，雙蒸水17.2μL，各反應物混合均勻后于95℃預變性10min，94 ℃變性45s；58 ℃退火30s；72 ℃延伸30s，共循環(huán)30次，最后72 ℃后延伸5min。

6、
　　 再次，利用建立的雙重PCR方法檢測人工模擬樣品，驗證其實際應用的可行性。使用微孔濾膜過濾富集樣品中的菌體后，采用改良DNA提取法抽提模板進行雙重PCR檢測。結果顯示無需對樣品進行培養(yǎng)，即可從富集后的樣品中檢測出目的基因。從樣品的富集到PCR產物的檢測，整個過程大約需要6h左右，且兩種病原菌的最低檢測限均達到102CFU/mL。表明建立的雙重PCR方法具有較好的應用可行性。
　　 最后，采用建立的雙重PCR方法對從

7、合肥地區(qū)采集的152份新鮮原料乳和50份市售乳制品進行檢測，同時以國標法進行對比驗證。結果從50份市售乳制品中均未檢測出兩種病原菌。在所檢測的152份新鮮原料乳中，雙重PCR方法和國標法檢出金黃色葡萄球菌的陽性率分別為75.00％和36.84％，致病性大腸桿菌的陽性率分別為47.37％和8.55％，同時檢出兩種病原菌的陽性率分別為38.16％和4.61％。兩種方法檢出金黃色葡萄球菌或致病性大腸桿菌的符合率分別為61.84％或61.18％