肝星狀細(xì)胞對(duì)卵圓細(xì)胞增殖、分化的調(diào)控及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、本研究分為三部分：
　　 第一部分、大鼠肝星狀細(xì)胞的原代分離，培養(yǎng)，鑒定
　　 目的:改進(jìn)大鼠肝星狀細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，提高細(xì)胞的得率、活力和純度。
　　 方法：采用離體膠原酶灌注消化與蛋白酶E 消化相結(jié)合的方法，通過(guò)25[％]percoll連續(xù)密度梯度離心，分離純化肝星狀細(xì)胞，并通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)，觀察其形態(tài)和免疫熒光檢測(cè)desmin表達(dá)測(cè)定其純度、活力。
　　 結(jié)果：每只大鼠可獲得肝星狀細(xì)胞1.3±0

2、.2×107個(gè)，細(xì)胞活率為(94±3)[％]，細(xì)胞活得率高于原有方法，通過(guò)免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞純度為(97±2)[％]。
　　 結(jié)論：本方法簡(jiǎn)單、使用、效果優(yōu)于原有方法。
　　 第二部分、肝星狀細(xì)胞誘導(dǎo)卵圓細(xì)胞分化為成熟肝細(xì)胞
　　 目的：研究肝星狀細(xì)胞在體外培養(yǎng)的卵圓細(xì)胞系LE6細(xì)胞向成熟肝細(xì)胞分化過(guò)程中的作用。
　　 材料與方法：(1)將LE6細(xì)胞分別與原代培養(yǎng)的肝星狀細(xì)胞混合共培養(yǎng)(co-mix)、采用

3、millicell小室不接觸共培養(yǎng)(co-sep)，LE6細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)作為對(duì)照；分第1周、第2周、第3周作為三個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀測(cè)，采用western blotting和realtime-PCR檢測(cè)肝細(xì)胞分化標(biāo)志物和卵圓細(xì)胞標(biāo)志物肝細(xì)胞核因子4 α(hepatocyte nuclearfactor-4 α，HNF-4 α)、白蛋白、甲胎蛋白(alphafetoprotein，AFP)、細(xì)胞角蛋白19(cytokeratin-19，CK-19)的

4、表達(dá)量；(2)電子透射顯微鏡觀察LE6細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化(3)periodic acid-schiff(PAS)染色檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)LE6細(xì)胞內(nèi)糖原顆粒的含量。(4)ELISA檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)LE6細(xì)胞分泌白蛋白的含量。
　　 結(jié)果：(1)隨著共培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，LE6細(xì)胞表達(dá)肝細(xì)胞標(biāo)志物HNF-4 α和白蛋白的量逐漸增加，明顯高于對(duì)照組，且混合共培養(yǎng)組的表達(dá)量明顯高于不接觸共培養(yǎng)組(P<0.01)；而LE6細(xì)胞標(biāo)志物AFP、CK-19的

5、表達(dá)量則逐漸降低，且混合共培養(yǎng)組的表達(dá)量明顯低于不接觸共培養(yǎng)組(P<0.01)。(2)LE6細(xì)胞共培養(yǎng)后白蛋白分泌量明顯增加，且混合共培養(yǎng)組高于不接觸共培養(yǎng)組(P<0.01)。(3)
　　 隨著共培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，LE6細(xì)胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和高爾基體等細(xì)胞器逐漸豐富，且細(xì)胞間形成毛細(xì)膽管結(jié)構(gòu)。(4)PAS 糖原染色顯示共培養(yǎng)后LE6細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量紅色糖原顆粒。
　　 結(jié)論：肝星狀細(xì)胞可以誘導(dǎo)LE6細(xì)胞向成熟肝細(xì)胞分化。肝星

6、狀細(xì)胞除了通過(guò)細(xì)胞因子等可溶性因子途徑發(fā)揮作用外，與LE6細(xì)胞的直接接觸也有著重要作用。
　　 第三部分、肝星狀細(xì)胞對(duì)卵圓細(xì)胞增殖的調(diào)控作用
　　 目的：研究在AAF/PH 卵圓細(xì)胞增殖模型中，肝切除后不同時(shí)間點(diǎn)肝星狀細(xì)胞對(duì)卵圓細(xì)胞增殖的調(diào)控作用。
　　 方法：將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為兩組：(1)肝切除組：大鼠建立AAF/PH 卵圓細(xì)胞增殖模型。(2)對(duì)照組：大鼠接受AAF處理，但不進(jìn)行肝切除，代之假手術(shù)。在70[％]

7、肝切除術(shù)或假手術(shù)后的不同時(shí)間點(diǎn)提取肝星狀細(xì)胞，收集原代肝星狀細(xì)胞條件培養(yǎng)液，通過(guò)MTT、PCNA 標(biāo)記以及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肝星狀細(xì)胞條件培養(yǎng)液對(duì)卵圓細(xì)胞系LE6細(xì)胞增殖、凋亡的影響。并通過(guò)ELISA檢測(cè)肝星狀細(xì)胞條件培養(yǎng)液中HGF、TGF-β、IL-10的含量，并通過(guò)相應(yīng)阻斷劑阻斷其作用，證實(shí)上述細(xì)胞因子對(duì)LE6細(xì)胞增殖凋亡的作用。
　　 結(jié)果：相對(duì)于肝切除前，經(jīng)肝切除后2、3 天提取肝星狀細(xì)胞條件培養(yǎng)液處理的LE6細(xì)胞PCNA

8、標(biāo)記率下降為為40.5±2.0[％]和25.3±5.3[％]，相對(duì)細(xì)胞數(shù)下降為0.668±0.128和0.388±0.104；6、9 天提取的肝星狀細(xì)胞條件培養(yǎng)液處理的LE6細(xì)胞的PCNA 標(biāo)記率上升為62.3±3.2[％]和85.4±4.3[％]，相對(duì)細(xì)胞數(shù)上升為：1.641±0.182和1.868±0.225；12，15天提取的肝星狀細(xì)胞條件培養(yǎng)液處理的LE6細(xì)胞的PCNA 標(biāo)記率下降為44.9±2.9[％]和44.2±2.8[％]

9、，相對(duì)細(xì)胞數(shù)下降為1.038±0.033和0.875±0.048；而LE6細(xì)胞凋亡的變化趨勢(shì)和PCNA 標(biāo)記率及相對(duì)細(xì)胞數(shù)變化趨勢(shì)相反。IL-10中和抗體、HGF 受體抑制劑PHA665752,TGF-β拮抗劑SB-431542可以阻斷不同時(shí)間點(diǎn)肝星狀細(xì)胞條件培養(yǎng)液對(duì)卵圓細(xì)胞增殖分化的影響。
　　 結(jié)論：在AAF/PH 卵圓細(xì)胞增值模型中，卵圓細(xì)胞介導(dǎo)的肝再生的不同階段肝星狀細(xì)胞分泌不同種類和不同量的細(xì)胞因子，并通過(guò)這些細(xì)胞因子