人心臟干細胞定向分化為心肌細胞的研究.pdf

1、研究背景
　　心肌梗死(MI)是引起缺血性心肌病(ICM)導致心力衰竭(HF)的主要病因之一。目前臨床上的治療主要包括藥物、介入、外科手術治療。藥物治療可以改善癥狀并降低冠心病風險;早期介入治療可以開通閉塞血管降低心肌梗死的死亡率;外科冠脈搭橋治療可以改善閉塞血管遠端心肌細胞的血液供應,改善癥狀。心臟移植治療可從根本上達到治療的目的,但存在免疫排除反應、供體數量有限,費用昂貴等問題。然而對于心肌缺血梗死后細胞喪失的問題,目前常用的

2、臨床治療方法均無法解決,不能達到心臟細胞水平重建的要求。心臟干細胞(CardiacStemCells,CSCs)具有自我復制、克隆形成、多向分化潛能,具有定向分化為心臟細胞系趨勢,而自體心臟干細胞移植治療不存在倫理問題、無免疫排斥反應,是治療心肌梗死及缺血性心肌病理想的種子細胞。目前國內外關于心臟干細胞向心肌細胞誘導分化的研究較多,但大多數為動物實驗,且由于實驗方法不同誘導分化的效率也頗有差異。人心臟干細胞因其獨特的性能,具有更廣泛的臨

3、床應用潛能,有望成為一種優(yōu)質高效治療心血管疾病的種子細胞。
　　研究目的
　　1.研究人心臟干細胞體外分離、培養(yǎng)及生物學特征。
　　2.探索人心臟干細胞的純化與鑒定方法。
　　3.探索5-AZA和AngII及聯(lián)合誘導人心臟干細胞向心肌細胞分化及提高分化率的方法。
　　研究方法
　　1.經患者或家屬同意并簽署知情同意書后從心外科手術中獲取人心臟右心耳組織,經Ⅱ型膠原酶消化、接種培養(yǎng),待其融合達90％左右

4、后進行傳代,選P2~P4細胞用流式細胞儀對其進行表面標志物CD117(c-kit)、CD31、CD45檢測。
　　2.P2~P8細胞與免疫熒光(PE)標記的心臟干細胞抗體CD117(c-kit)結合后經流式細胞儀無菌分選純化心臟干細胞,對無菌分選純化后的c-kit+CSCs進行培養(yǎng)、細胞形態(tài)學觀察及免疫熒光染色鑒定。
　　3.選取無菌分選純化后細胞融合90%左右的c-kit+CSCs進行誘導、分化實驗。實驗隨機分為4組:①空

5、白對照組(Control組普通細胞培養(yǎng)液)、②5-AZA誘導組(10μmol/L)、③AngII誘導組(0.1μmol/L)、④5-AZA和AngII聯(lián)合誘導組(10μmol/L+0.1μmol/L)。空白對照組更換普通細胞培養(yǎng)液培養(yǎng);5-AZA、AngII單獨誘導組誘導24h后棄去誘導培養(yǎng)液,PBS洗滌2次,更換普通細胞培養(yǎng)液培養(yǎng);5-AZA和AngII聯(lián)合誘導組24h后棄去5-AZA誘導培養(yǎng)液,PBS洗滌2次,更換AngII誘導培養(yǎng)

6、液,24h后PBS洗滌2次,更換普細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。分別在96h、4W觀察細胞形態(tài)變化;4W后用免疫熒光染色、WesternBlotting測定心肌細胞特異性蛋白cTnI、Cx43的表達;用流式細胞儀測定各組心肌細胞分化率。
　　研究結果
　　1.原代細胞形態(tài)學特征:倒置相差顯微鏡下觀察,細胞10d左右貼壁,貼壁細胞大小不一,呈三角形、梭形、多角形。貼壁1W后細胞快速增殖,向四周呈集落樣生長,20d左右融合達到80%。

7、r>　　2.細胞表面標志物流式細胞儀檢測:用流式細胞儀對細胞表面CD117、CD31、CD45標志物檢測,統(tǒng)計結果顯示:CD117陽性表達率為(26.4±7.52)%、CD31陽性表達率為(8.5±3.81)%、CD45陽性表達率為(1.85±0.51)%。
　　3.人心臟干細胞純化及免疫熒光染色鑒定:流式細胞儀無菌分選獲得純度約為98.5%的c-kit+CSCs。倒置相差顯微鏡下觀察純化的c-kit+CSCs,細胞24h內均勻貼

8、壁,細胞體積較原代細胞小,形態(tài)相似,呈長梭形或短梭形,折光性強,經7d左右停滯期后細胞快速擴增,14d左右融合達80%。免疫熒光顯微鏡下觀察幾乎所有細胞有都表達紅色熒光(PE-CD117),細胞呈長梭形或短梭形,細胞核圓、居中。
　　4.人心臟干細胞誘導后細胞形態(tài)學特征:誘導96h后,Control組細胞形態(tài)沒有明顯改變,排列無規(guī)律性;5-AZA組細胞死亡脫落明顯,細胞近似梭形,以簇狀排列為主;AngII組細胞近似梭形,以條梭狀排

9、列為主;AngII和5-AZA聯(lián)合組細胞少量死亡脫落,細胞近似梭形,排列呈以簇狀或條索狀。4W后Control組:細胞體積大小不均一,呈長梭狀或短梭狀、多角形等,少數細胞形態(tài)較誘導前變長,無明顯排列規(guī)律;各誘導組細胞形態(tài)均變長,以梭形細胞為主,排列呈束狀,5-AZA和AngII聯(lián)合組細胞形態(tài)、排列變化最為顯著。
　　5.人心臟干細胞誘導后心肌細胞特異性蛋白cTnI、Cx43測定:誘導4W后免疫熒光、Westernblotting結

10、果顯示,四組細胞中均有cTnI、Cx43表達,Control組表達最弱,5-AZA和AngII聯(lián)合組表達最強。統(tǒng)計結果顯示:5-AZA組、5-AZA和AngII聯(lián)合組表達高于Control組,有顯著統(tǒng)計學差異(P<0.01);5-AZA和AngII聯(lián)合組表達高于AngII組,有顯著統(tǒng)計學差異(P<0.01);5-AZA和AngII聯(lián)合組表達高于5-AZA組,有統(tǒng)計學差異(P<0.05);5-AZA組表達高于AngII組,有計學差異(P<

11、0.05);AngII組高于Control組,有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。
　　6.人心臟干細胞誘導后心肌細胞分化率測定:誘導4W后流式細胞儀分析各組心肌細胞分化率,統(tǒng)計結果顯示:Control組(28.86±4.62)%、5-AZA組(53.71±7.5)%、AngII組(41.48±7.12)%、5-AZA和AngII聯(lián)合組(65.74±6.21)%;四組間見均有統(tǒng)計學差異(P<0.05);5-AZA組、5-AZA和AngI

12、I聯(lián)合組高于Control組,有顯著統(tǒng)計學差異(P<0.01)。
　　研究結論
　　1.采用酶消化法可以從人右心耳組織中分離培養(yǎng)出人心臟干細胞。
　　2.通過流式細胞儀無菌分選純化獲得高純度的c-kit+CSCs,人c-kit+CSCs在心臟干細胞培養(yǎng)液中可以快速生長增殖。
　　3.人c-kit+CSCs能夠在普通細胞培養(yǎng)液中向心肌細胞分化,具有自我分化可能性,但速度較慢。
　　4.5-AZA、AngII均