葡萄籽提取物原花青素對(duì)人膀胱癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用及機(jī)制研究.pdf

1、本研究分為四部分：
　　 第一部分：葡萄籽提取物原花青素對(duì)人膀胱癌BIU87細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用
　　 目的：探討葡萄籽提取物原花青素(grape seed procyanidin extract，GSPE)對(duì)人膀胱癌BIU87細(xì)胞及人原代皮膚成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。
　　 方法：體外培養(yǎng)的人膀胱癌BIU87細(xì)胞及人原代皮膚成纖維細(xì)胞與12.5、25、50、100和200 μg/ml GSPE共同孵育24 h后，觀察

2、細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變；并采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法測(cè)定其對(duì)人膀胱癌BIU87細(xì)胞及人原代皮膚成纖維細(xì)胞存活的影響。
　　 結(jié)果：與對(duì)照組相比，50、100、200 μg/ml GSPE可引起B(yǎng)IU87細(xì)胞形態(tài)的明顯改變，各濃度GSPE對(duì)人原代皮膚成纖維細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯影響。12.5、25、50、100、200 μg/ml GSPE作用細(xì)胞24 h后，人膀胱癌BIU87細(xì)胞存活率分別為對(duì)照組的99.55±0.50% (n=18，P

3、>0.05)，99.16±0.63% (n=18，P>0.05)，86.98±1.48%(n=18，P<0.01)，68.18±2.06% (n=18，P<0.01)和51.42±1.78% (n=18，P<0.01)；與對(duì)照組相比，50、100、200 μg/ml GSPE可明顯抑制BIU87細(xì)胞生長(zhǎng)，但對(duì)人原代皮膚成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)明顯抑制作用。
　　 結(jié)論：在一定濃度范圍內(nèi)，GSPE可呈劑量依賴性抑制人膀胱癌BIU87細(xì)胞生

4、長(zhǎng)，但對(duì)人原代皮膚成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)明顯影響。
　　 第二部分：葡萄籽提取物原花青素對(duì)人膀胱癌BIU87細(xì)胞周期的影響及其機(jī)制探討
　　 目的：探討GSPE對(duì)人膀胱癌BIU87細(xì)胞周期的影響及其可能機(jī)制。
　　 方法：將50、100、200 μg/ml的GSPE作用于人膀胱癌BIU87細(xì)胞24 h后，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期改變，采用RT-PCR及Western blot方法檢測(cè)cyclin D1和CDK4 m

5、RNA及蛋白水平的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：流式細(xì)胞分析表明，GSPE可使人膀胱癌BIU87細(xì)胞阻滯于G1期，0、50、100、200 μg/ml GSPE對(duì)應(yīng)的阻滯于G1期的腫瘤細(xì)胞平均比例分別為48.46、55.73、69.81和 79.18%。RT-PCR及Western blot分析表明，隨著GSPE濃度的增高，BIU87細(xì)胞cyclin D1和CDK4 mRNA及蛋白表達(dá)減少，半定量分析顯示，各濃度組間差別有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)

6、意義 (P<0.01)。
　　 結(jié)論：GSPE可呈濃度依賴性阻滯BIU87細(xì)胞于G1期。其機(jī)制可能與下調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)因子cyclin D1和CDK4的表達(dá)有關(guān)。
　　 第三部分：葡萄籽提取物原花青素對(duì)人膀胱癌BIU87細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制探討
　　 目的：探討GSPE對(duì)人膀胱癌BIU87細(xì)胞凋亡的影響及其可能機(jī)制。
　　 方法：將50、100和200 μg/ml的GSPE作用于人膀胱癌BIU87細(xì)胞24

7、 h后，采用Hoechst 33258凋亡熒光染色觀察細(xì)胞核形態(tài)改變，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，RT-PCR及Western blot方法檢測(cè)caspase-3和survivin mRNA及蛋白的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：Hoechst 33258凋亡染色結(jié)果表明，GSPE可使BIU87細(xì)胞核呈現(xiàn)明顯的凋亡形態(tài)學(xué)改變。流式細(xì)胞分析表明，GSPE可誘導(dǎo)BIU87細(xì)胞凋亡，0、50、100和200 μg/ml GSPE對(duì)應(yīng)的BIU87

8、細(xì)胞的平均凋亡率分別為0.3、8.7、28.2和40.6%。RT-PCR及Western blot分析表明，隨著GSPE濃度的增高，BIU87細(xì)胞caspase-3 mRNA及蛋白表達(dá)增多，survivin mRNA及蛋白表達(dá)減少，半定量分析顯示各組間差別均有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　 結(jié)論：GSPE可呈濃度依賴性誘導(dǎo)BIU87細(xì)胞凋亡。其機(jī)制可能與下調(diào)凋亡抑制基因survivin有關(guān)。
　　 第四部分：絲

9、裂霉素C聯(lián)合葡萄籽提取物原花青素對(duì)人膀胱癌BIU87細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用
　　 目的：探討絲裂霉素C(mitomycin C，MMC)與GSPE聯(lián)合應(yīng)用對(duì)人膀胱癌BIU87細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。
　　 方法：采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法測(cè)定MMC與GSPE單獨(dú)和聯(lián)合應(yīng)用時(shí)對(duì)人膀胱癌BIU87細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，并應(yīng)用Chou-Talalay聯(lián)合指數(shù)(combination index，CI)法定量分析藥物之間的相互作用

10、效果。
　　 結(jié)果：MMC和GSPE單獨(dú)應(yīng)用時(shí)，BIU87細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用隨藥物濃度的增加而增加，中效濃度分別為15.422 μg/ml和195.865 μg/ml。MMC與GSPE聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，作用效果表現(xiàn)為在低濃度(01)，中效濃度為109.496 μg/ml (其中MMC為8.111 μg/ml，GSPE為101.385 μg/m