bFGF-雙層膠原基復合材料修復關節(jié)軟骨缺損及其相關研究.pdf

1、創(chuàng)傷修復過程是多種生長因子協(xié)調的時空控制過程。應用外源性生長因子在組織修復過程中顯示了較好的應用前景，但是實現生長因子的時空控制，進而實現創(chuàng)傷組織的再生修復，仍然存在著巨大的挑戰(zhàn)。組織工程方法的出現，為解決組織修復提供了一個新的途徑。構建具有時空控制釋放特點的載生長因子組織工程支架已成為一個新的研究方向。時空控制釋放生長因子體現了生長因子釋放的兩個特點：1．所釋放的生長因子聚集與創(chuàng)傷組織局部，作用于相應的靶組織和細胞，并避免釋放于周圍組

2、織引起的不可預期結果；2．生長因子釋放應該持續(xù)足夠長的時間，滿足組織再生修復的需求。
　　 生長因子的釋放與支架材料的結構存在一定的相關性。通過調整支架材料的疏松或致密結構，可以改變所負載生長因子的釋放行為。據此，本研究設計制備一種具有雙側疏松或致密程度不同的雙層結構材料，以期通過材料的結構差異調整生長因子的釋放行為，實現所負載生長因子的時空控制釋放。并將所制備材料應用于傳統(tǒng)的治療方法如軟骨下鉆孔術、微骨折、自體骨軟骨鑲嵌成型術

3、和自體軟骨細胞移植術等難以實現有效修復的的創(chuàng)傷軟骨組織。
　　 1．研究中選用膠原材料為主要原材料構建組織工程支架。由于堿性成纖維細胞生長因子(basicFibroblastGrowthFactor，bFGF）是體內最有效的有絲分裂原之一,對軟骨細胞、間充質干細胞有顯著的促有絲分裂作用。此外，bFGF還具有促進未分化間充質細胞向軟骨細胞方向分化、促血管增生作用。因此，選用bFGF為模型生長因子。研究中將載有bFGF的納米顆粒負載

4、于雙側致密程度不同的膠原膜材料之間，進而獲得復合支架材料。并對材料進行體外釋放行為、體外細胞培養(yǎng)以及關節(jié)軟骨修復的研究。具體研究內容包括：制備一種復合負載bFGF的殼聚糖-肝素(CS-Hep)納米粒子的雙層膠原基復合材料，雙層膠原膜分別采用冷凍干燥法和風干法制備，分別命名為CFM和CAM，對其進行掃描電鏡和紅外表征；采用流池法，考察復合材料在PBS和膠原酶溶液兩種不同釋放介質中對模型蛋白HSA的釋放行為，同時應用激光共聚焦顯微鏡觀察異硫

5、氰酸熒光素(FITC)標記的HSA在PBS溶液中的釋放情況。
　　 2．體外培養(yǎng)L-929細胞，分別接種于復合bFGF雙層膠原基復合材料(bDM)和未復合bFGF雙層膠原基復合材料(DM)以及交聯(lián)的凍干膠原膜(CFM)表面，用四甲基偶氮唑鹽微量反應比色法(MTT)法、激光共聚焦顯微鏡觀察細胞在第3、5天的粘附和增殖的情況。
　　 3．制備bFGF/雙層膠原基復合材料浸提液，進行急性全身毒性試驗、溶血試驗、熱原試驗和細胞毒

6、性試驗，對材料進行生物安全性評價。
　　 4.選取60只家兔，隨機分成5組bDM-CFM（bDM材料CFM朝向軟骨下骨面）組、bDM-CAM（bDM材料CAM朝向軟骨下骨面）組、DM-CFM（DM材料CFM朝向軟骨下骨面）組、DM-CAM（DM材料CAM朝向軟骨下骨面）組、假手術對照（單純缺損不加干預）組。于兔雙側膝關節(jié)構建軟骨缺損模型，將材料分別按CFM和CAM層朝向軟骨下骨面植入缺損處，術后1、2、4、8、12、16周采集標

7、本，通過大體觀察、組織學評分、免疫組化檢測Ⅱ型膠原，分析不同處理組軟骨修復的情況。并在上述實驗的同時，于第3d、1w、2w、4w、8w分別抽取關節(jié)液，用抗體芯片檢測20種相關生長因子、細胞因子及炎性趨化因子的時間變化情況。
　　 實驗結果表明，bFGF/雙層膠原基復合材料兩側疏松程度差異明顯。在體外釋放實驗中，釋放液為PBS時，CAM→CFM釋放百分率高；而在膠原酶釋放液中，CFM→CAM組釋放百分率高，FITC標記的HSA釋放

8、實驗顯示雙層材料對于蛋白分子具有不均一的釋放特點。這些結果提示，所構建的支架材料對生長因子具有時空控制性釋放特點。
　　 在體外細胞培養(yǎng)實驗中，所有材料均顯示良好的細胞粘附和促增殖作用，同時包載bFGF組細胞增殖率較相應未包載bFGF組更高(P＜0.05)。包載bFGF材料由于結構的差異導致bDM-CFM層更有利于細胞粘附和增殖(P＜0.05），這可能與bDM-CFM對生長因子有時空控制釋放特性有關；激光共聚焦顯微鏡觀察結果也證

9、實了這一觀點。
　　 生物學評價研究發(fā)現，bFGF/雙層膠原基復合材料浸提液pH值為6.55±0.13，接近中性；急性全身毒性試驗、熱原試驗、溶血試驗均為陰性,細胞毒性為0級，說明本材料具有良好的生物安全性，對機體無毒，對細胞有較強的親和作用。
　　 關節(jié)軟骨修復過程中，對不同時期關節(jié)液中生長因子、細胞因子及炎性趨化因子進行抗體芯片檢測，結果表明因材料結構不同而引起的生長因子釋放不同可導致被檢因子表現出不同的時間變化過程