與HSV-1 UL31相互作用的宿主蛋白TMEM140生物學功能研究.pdf

1、單純皰疹病毒Ⅰ型是一種結構復雜,感染形式多樣,病理效應復雜的一種雙鏈DNA病毒,與RNA病毒的感染在胞質中完成病毒顆粒的裝配形式不同,皰疹病毒的DNA復制、衣殼體的形成、病毒顆粒的組裝均是在核內進行。衣殼體將基因組包裹后,穿過核內膜,以出芽的方式進入核周隙,衣殼體在穿過核內膜的同時完成初膜化。病毒蛋白u131和u134以復合體的形式促進了這一過程[13]。
　　 鑒于病毒與宿主間相互競爭的關系。在病毒感染過程中,宿主必然采取某種

2、防御機制來進行自我保護。為了了解病毒組裝及出核期間與細胞分子作用的相關機制,本實驗將UL31基因作為誘餌基因,利用酵母雙雜交體系和人肝組織cDNA預制文庫,初步篩選出與UL31相互作用的候選蛋白,通過自激活、β-gal、免疫共沉淀等實驗的進一步篩選,我們最后確定TMEM140作為主要研究對象,探究其在病毒裝配釋放中的功能作用。本課題以分子生物學、病毒學、細胞生物學和免疫學等實驗為基礎對TMEM140的功能特性進行了研究。首先,通過熒光定

3、位實驗觀測TMEM140-GFP在細胞中的定位,結果可見正常狀態(tài)下TMEM140-GFP融合蛋白定位于胞漿中,但當感染了HSV1后,部分TMEM140-GFP蛋白向胞核轉移。接著,通過噬斑形成實驗(PFU)觀察到當TMEM140高表達時可以抑制HSV1病毒的增殖活性。而當我們干擾TMEM140在細胞中的表達時,抑制作用得以逆轉。隨后,通過透射電鏡分別觀察病毒在高表達TMEM140的細胞以及正常細胞中的分布情況,發(fā)現正常細胞病變程度較大,

4、病毒顆粒大部分釋放到胞外,而高表達了TMEM140的實驗組中病毒以組裝好的衣殼形態(tài)大量存在于核內。之后,實驗構建了連入UL31CR1區(qū)片段的標簽載體,通過免疫共沉淀實驗證明了TMEM140是與UL31CR1區(qū)結合,而這一區(qū)域正好是UL34與UL31結合形成UL31/UL34復合體的關鍵區(qū)域。接著,通過生物信息學的方法對六種皰疹病毒UL31 CR1區(qū)同源蛋白氨基酸序列進行比對,確定了6個保守位點,分別將這6個保守位點進行定點突變,用免疫共

5、沉淀的方法驗證突變點對TMEM140與UL31的結合是否有影響,結果顯示,HSV1第94位氨基酸的改變對TMEM140與UL31的結合存在直接的影響。
　　 通過對TMEM140蛋白功能的初步分析,基于以上實驗結果,初步推測:TMEM140很有可能是作為UL34的競爭者與UL31結合,從而阻斷了UL31/UL34復合體的形成,進而削弱了UL31/UL34幫助病毒顆粒出核形成成熟病毒釋放的作用,最終對病毒的裝配釋放起到抑制作用。以