維甲酸調控Th17-Treg免疫失衡在牙周炎中的作用研究.pdf

1、實驗目的
　　采用高菌量牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis，P.gingivalis)感染小鼠口腔的方法建立牙周炎動物模型，明確牙周炎發(fā)病過程中輔助性T(Thelper，Th)17細胞和調節(jié)性T(regulatoryT，Treg)細胞的免疫狀態(tài);通過體內對P.gingivalis誘導的牙周炎小鼠進行全反式維甲酸(all-transretinoicacid，ATRA)干預和體外采用維甲酸受體(retino

2、idacidreceptor，RAR)α拮抗劑LE135阻斷的實驗體系，明確ATRA對牙周炎的作用，分析ATRA對牙周炎中Th17細胞和Treg細胞免疫狀態(tài)的影響并進一步探討相關的作用機制。
　　實驗方法
　　1、Th17細胞和Treg細胞在牙周炎小鼠中的免疫狀態(tài)分析
　　選用7周齡C57BL/6雌性小鼠，以1×109P.gingivalisW83連續(xù)7天感染小鼠口腔，建立牙周炎動物模型。于感染后的第4周取材，通過測量

3、從釉牙骨質界(cemento-enameljunction，CEJ)到牙槽嵴頂?shù)木嚯x(alveolarbonecrest，ABC)評價牙槽骨吸收情況;采用蘇木素-伊紅(Hematoxylinandeosin，HE)染色的方法觀察牙周組織中炎細胞浸潤、結締組織附著喪失和牙槽骨吸收情況;應用流式細胞儀分析技術檢測頸部淋巴結、外周血和脾臟中CD4+T細胞在淋巴細胞中的細胞比例、CD4+維甲酸相關核孤兒受體(retinoid-relatedor

4、phanreceptor，ROR)γτ+(RORγτ為Th17細胞特征性轉錄因子）、CD4+叉頭翼螺旋轉錄分子(forkheadboxP3，F(xiàn)oxp3)+(Foxp3為Treg細胞特征性轉錄因子)和核因子-κB受體活化因子配體(receptoractivatorofnuclearfactor-κBligand，RANKL)+CD4+細胞在總的CD4+T細胞中的細胞比例和細胞數(shù)量;應用實時定量反轉錄-聚合酶鏈反應(reversetrans

5、cription-polymerasechainreaction，RT-PCR)方法檢測牙齦組織和頸部淋巴結中Th17細胞相關因子白細胞介素(interleukin，IL)-17A和Treg細胞相關細胞因子IL-10和轉化生長因子(transforminggrowthfactor，TGF)-β1mRNA的表達;酶聯(lián)免疫吸附技術(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)檢測牙齦組織、頸部淋巴結、血清和脾

6、臟中IL-17A、IL-10和TGF-β1的蛋白表達情況。
　　2、ATRA對牙周炎小鼠Th17細胞和Treg細胞免疫狀態(tài)的影響及相關機制研究
　　選用7周齡C57BL/6雌性小鼠，以P.gingivalis誘導建立的牙周炎小鼠為研究對象，體內隔日灌胃ATRA(25μg/g體重)和體外給予不同實驗組ATRA(2×10-5mol/L)及ATRA(2×10-5mol/L)+維甲酸受體(retinoidacidreceptor，R

7、AR)α阻斷劑LE135(2×10-5mol/L)，進行實驗研究。動態(tài)監(jiān)測小鼠的體重，觀察P.gingivalis感染后小鼠的體重變化;測量從CEJ到ABC的距離評價牙槽骨的吸收情況;HE染色法觀察牙周組織中炎細胞浸潤、結締組織附著喪失和牙槽骨吸收情況;應用流式細胞儀分析技術檢測頸部淋巴結、外周血、脾臟以及體外培養(yǎng)細胞中CD4+T細胞在淋巴細胞中的細胞比例、CD4+RORγτ+(Th17)、CD4+Foxp3+(Treg)和RANKL+

8、CD4+細胞在總的CD4+T細胞中的細胞比例和細胞數(shù)量;應用實時定量RT-PCR方法檢測牙齦組織和頸部淋巴結中Th17細胞相關細胞因子IL-17A和Treg細胞相關細胞因子IL-10和TGF-β1mRNA的表達;ELISA方法檢測牙齦組織、頸部淋巴結、血清、脾臟和體外培養(yǎng)細胞上清中IL-17A、IL-10和TGF-β1的蛋白表達水平;應用四甲基偶氮唑藍(3-[4，5-dimethylthiazol-2-yl]-2，5-diphen-yl

9、tetrazoliumbromide，MTT)法檢測頸部淋巴結和脾臟淋巴細胞的增殖情況。此外，為了排除ATRA對P.gingivalisW83的直接作用，以不同濃度(2×10-5mol/L、2×10-6mol/L、2×10-7mol/L)的ATRA處理P.gingivalisW83，通過比色法分析P.gingivalisW83生長率;以不同濃度(2×10-5mol/L、2×10-6mol/L、2×10-7mol/L)ATRA處理的P.g

10、ingivalisW83與1％羊紅細胞共培養(yǎng)，觀察紅細胞的凝集情況;以不同菌量(3×109、2×109、1×109)ATRA(2×10-5mol/L)處理的P.gingivalisW83皮下注射，觀察小鼠的生存情況和測量注射區(qū)皮損大小。
　　實驗結果
　　1、在牙周炎中存在Th17/Treg免疫失衡
　　(1)與P.gingivalis感染對照組小鼠相比，牙周炎小鼠的Th17細胞在CD4+T細胞中的細胞比例和細胞數(shù)量顯

11、著增加，而Treg細胞的細胞比例明顯降低，Treg細胞的細胞數(shù)量變化不顯著;
　　(2)與P.gingivalis感染對照組小鼠相比，雖然牙周炎小鼠Th17細胞相關促炎性細胞因子IL-17A以及Treg細胞相關抑炎性細胞因子IL-10和TGF-β1表達增高，但IL-10和TGF-β1不能有效對抗增高的IL-17A，不能抑制牙周炎。
　　此外，與P.gingivalis感染對照組小鼠相比，牙周炎小鼠的牙齦組織、頸部淋巴結和外周

12、血中Th17細胞和Treg細胞及相關細胞因子的變化較脾臟明顯。
　　2、ATRA通過調控Th17/Treg免疫失衡抑制牙周炎
　　(1)ATRA抑制P.gingivalis誘導的小鼠牙周炎:ATRA有效抑制P.gingivalis誘導的牙槽骨吸收，減輕牙周組織的炎癥程度和結締組織附著喪失。
　　(2)ATRA顯著下調Th17細胞介導的免疫應答，上調Treg細胞介導的免疫應答:體內外實驗中，ATRA有效降低CD4+ROR

13、γτ+(Th17)細胞的細胞比例和細胞數(shù)量并下調其相關的促炎性細胞因子IL-17A的表達，降低RANKL+CD4+細胞的細胞比例和細胞數(shù)量，同時增加CD4+Foxp3+(Treg)細胞的細胞比例并上調其相關的抑炎性細胞因子IL-10和TGF-β1的表達。體外研究發(fā)現(xiàn)，ATRA對Th17/Treg免疫失調的調控作用以及對RANKL+CD4+細胞的抑制作用可被RARα拮抗劑LE135阻斷。而且，我們從P.gingivalisW83的生長率、

14、凝集能力和毒力三個方面分析了ATRA對P.gingivalisW83的直接影響。研究發(fā)現(xiàn)，雖然ATRA能降低P.gingivalisW83的生長率，但差異無統(tǒng)計學意義;在凝集功能方面，不同濃度(2×10-5mol/L、2×10-6mol/L、2×10-7mol/L)的ATRA對P.gingivalisW83凝集羊紅細胞的功能無明顯影響;在相同菌量注射后，ATRA對小鼠的生存率無明顯影響，并且雖然在注射后的第2天和第6天ATRA組小鼠的皮

15、損小于DMSO對照組，但差異無統(tǒng)計學意義。
　　此外，ATRA組小鼠牙齦組織、頸部淋巴結和外周血中Th17細胞和Treg細胞及相關的細胞因子受ATRA的影響較脾臟更為顯著。
　　結論
　　1、在牙周炎小鼠中存在Th17/Treg免疫失衡狀態(tài)，表現(xiàn)為Th17細胞介導的免疫應答增強，而Treg細胞介導的免疫應答減弱。
　　2、牙齦組織、頸部淋巴結和外周血可能是宿主對抗牙周致病菌產生免疫應答的主要細胞來源。