可拆分獲得手性藥物（S）-酮基布洛芬基因工程菌的構建及性質鑒定.pdf

1、利用生物系統(tǒng)獲得光學純化合物已經逐漸成為化學合成方法之外的另一選擇。2-芳基丙酸類藥物是一類重要的非甾體抗炎藥。利用微生物中脂肪酶立體選擇性的拆分，獲得具有光學活性的2-芳基丙酸類藥物(如：酮基布洛芬和奈普生)的單一對映體己成為該研究領域的熱點之一。 本文以本實驗室篩選出的具有一定不對稱轉化外消旋酮基布絡芬氯乙酯生成(S)-酮基布洛芬能力的菌株NK13＃及從該菌2～6kbp大小DNA片斷的基因組文庫中篩選得到的含酯酶基因的轉化子

2、為材料，通過亞克隆構建了一株表達重組菌，采用水解三丁酸甘油酯的透明圈法篩選到了目的克隆。 經PCR擴增、克隆和核苷酸測序，并將測序結果與Genbank中已知基因序列進行同源性比對，證明亞克隆得到的酯酶屬首次發(fā)現，提交GENBANK，注冊號為：DQ196347。提取的克隆質粒中包含完整的酯酶可讀框長933bp，編碼310個氨基酸，分析表明該酯酶為疏水的酸性蛋白。 利用PhenylSepharoseCL-4B疏水柱層析柱取代

3、了昂貴的Ni柱進行蛋白分離純化，經SDS-PAGE電泳檢測證明疏水層析純化到了單一的34KDa酯酶蛋白。 實驗中以不同濃度的IPTG和乳糖作為誘導劑，進行了比較，發(fā)現了低濃度的外消旋乳糖同樣可以誘導表達菌株大量產酶；同時，質粒的穩(wěn)定性實驗，證實了連續(xù)遺傳100代后，表達菌株中的pET-NKestl質粒穩(wěn)定性仍高達90％以上，這些對于工業(yè)生產都有著非常重要的實際意義。 薄層層析與HPLC檢測結果顯示，表達菌株的轉化效率明顯

4、提高，由亞克隆前菌株12小時可以轉化62.6％的酮基布洛芬氯乙酯到表達菌45分鐘就能轉化47.4％，而得到的(S)-酮基布洛芬過量(e.e.％)達到55.46％(S-酮基布洛芬為77.73％，R-酮基布洛芬為22.27％)，是原始野生型NK13＃菌株轉化光學純度e.e.％(5.84％)的9.5倍，充分說明了該酯酶具有優(yōu)先拆分得到S-酮基布洛芬的特性。如果能對表達重組菌生長條件及轉化底物時的條件(pH、溫度、轉化率等)進一步優(yōu)化，將有望得

5、到更高光學純度的S-酮基布洛芬。 借助不同的網絡服務器和生物學軟件分析了該酯酶蛋白的一級結構、二級結構，探討了酯酶的高級結構與功能，初步分析說明了該酯酶N’端的203位點的氨基酸殘基，可能是影響酶蛋白拆分手性藥物能力的關鍵位點。如果能進一步通過人工合成特定堿基序列、表達出具有專一性拆分得到S-酮基布洛芬能力的酯酶，從而通過實驗證實影響酯酶光學純拆分能力的活性位點，必將對研究包括酮基布洛芬在內的許多手性藥物的生物酶法拆分起到極其重