TC-1的表達水平與肺腺癌胸水腫瘤細胞抗脫落凋亡的相關性研究.pdf

1、脫落凋亡,為上皮細胞與其細胞外基質(zhì)(extra cellular matrix, ECM)脫離后繼而出現(xiàn)的細胞凋亡,1994年Frisch SM等首次報道了這一現(xiàn)象,并命名為“anoikis”[1]。
　　脫落凋亡為機體的一種自我保護機制,其意義在于它可防止上皮細胞與ECM脫離后經(jīng)各種管道系統(tǒng)或經(jīng)機體各種腔隙播散至其它臟器繼續(xù)生長,保證機體穩(wěn)態(tài)結構。癌細胞作為上皮細胞來源的惡性腫瘤細胞卻能自原發(fā)部位脫落后,遷徙到其它部位臟器中繼續(xù)

2、生長,甚至其異位的環(huán)境完全不適合原部位正常上皮細胞的生長,而形成轉移瘤[2]。
　　這一現(xiàn)象說明能夠發(fā)生轉移的癌細胞具備抗脫落凋亡能力?？姑撀涞蛲霰粡V泛認為是腫瘤轉移的一種重要原因。肺癌胸膜轉移致胸膜腔可形成惡性胸腔積液(malignant pleural effusion,MPE)。胸水中懸浮有大量的腫瘤細胞,這些腫瘤細胞能夠在MPE中懸浮狀態(tài)下存活并在臟壁層胸膜種植轉移,使臟層及壁層胸膜形成轉移灶。
　　這一現(xiàn)象說明惡性

3、胸水中的腫瘤細胞已具備抗脫落凋亡能力。因此,胸水中的腫瘤細胞為機體內(nèi)相對易取的典型抗脫落凋亡細胞。脫落凋亡/抗脫落凋亡機制復雜,目前尚未闡明;大量研究表明,有多種因素可能參與了腫瘤細胞脫落凋亡/抗脫落凋亡調(diào)節(jié)機制,包括多種信號傳導途徑及其它相關因素;TC-1(C8orf4)基因是近期發(fā)現(xiàn)的與炎癥及腫瘤相關的基因。最早發(fā)現(xiàn)其在甲狀腺癌中表達異常增高[3],同時有研究報道其在懸浮培養(yǎng)的高侵襲性肺腺癌A549細胞系中同樣高表達[4-5]。然而

4、TC-1基因在肺癌中的表達水平與肺癌的發(fā)生發(fā)展及轉移侵襲能力的關系尚無定論,其在肺癌抗脫落凋亡屬性中的作用上仍需進一步考證。
　　目的:
　　探討惡性胸水腫瘤細胞分離的合適方法,建立肺腺癌腫瘤細胞抗脫落凋亡模型。對胸水中的腫瘤細胞進行生物學及形態(tài)學研究,并探討TC-1基因的表達水平與肺腺癌腫瘤細胞抗脫落凋亡之間的關系。
　　方法:
　　一:取已病理確診肺腺癌胸膜轉移的惡性胸水腫瘤細胞,利用多聚羥乙基甲基丙烯酸樹脂

5、處理培養(yǎng)皿,致細胞無法貼壁生長,通過梯度密度離心法分離并純化腫瘤細胞,建立胸水腫瘤細胞抗脫落凋亡模型;
　　二:以肺腺癌原發(fā)灶原代培養(yǎng)腫瘤細胞為對比,對胸水腫瘤細胞進行形態(tài)學觀察、MTT法測定細胞數(shù),繪制生長曲線和計算細胞倍增時間、流式細胞儀測定細胞周期分布及細胞凋亡率;
　　三:利用免疫組織化學法及western blot法檢測TC-1基因在原發(fā)灶腫瘤細胞及胸水腫瘤細胞間的表達差異,MTT法檢測TC-1基因相關通路抑制劑對

6、兩組腫瘤細胞的抑制效果。
　　結果:
　　一:利用兩次梯度密度離心法可有效分離純化胸水中的腫瘤細胞,建立體外懸浮培養(yǎng)人體胸水腫瘤細胞抗脫落凋亡模型,體外懸浮培養(yǎng)時間約4周左右。
　　二:對胸水腫瘤細胞的生物學及形態(tài)學的研究發(fā)現(xiàn):
　　1.原發(fā)灶腫瘤細胞的生長曲線存在明顯的階段分布:即潛伏期、對數(shù)期、平臺期;而胸水腫瘤細胞其生長曲線低平,近似直線,無明顯階段分布,細胞增殖緩慢,細胞倍增時間為(115.74±15.3

7、8)h;
　　2.細胞周期分布檢測,胸水腫瘤細胞的細胞周期分布為:G0、G1期(58.95±4.13)％、S期(26.2±3.7)％、G2期(14.85±1.3)％;近60％的細胞處于細胞靜止期;
　　3.細胞凋亡率:原發(fā)組及胸水組中活細胞數(shù)占90％以上,凋亡及壞死細胞總數(shù)小于10％。原發(fā)灶腫瘤細胞懸浮培養(yǎng)48h后活細胞數(shù)為(38.9±6.9)％,凋亡及壞死細胞總數(shù)大于60％;
　　4.掃描電鏡示胸水組與原發(fā)組相比較,

8、胸水組中腫瘤細胞呈現(xiàn)發(fā)育缺陷,其細胞膜微孔增大增多、細胞纖毛減少、呈球樣及板樣變;少量腫瘤細胞出現(xiàn)凋亡小泡呈凋亡前期樣變化。
　　三:
　　1.免疫組織化學及western blot檢測TC-1基因在胸水腫瘤細胞中表達水平明顯高于原發(fā)灶腫瘤細胞,兩組細胞在TC-1的表達水平上存在差異;
　　2.應用TC-1通路相關抑制劑PD176074可促使懸浮著的胸水腫瘤細胞出現(xiàn)大批凋亡及壞死,抑制率為54.43％,而PD17607