基于小鼠胚胎干細胞和人誘導性多能干細胞分別建立發(fā)育毒性模型及應用的研究.pdf

1、[目的]：
　　發(fā)育毒性的評價方法存在許多難點和重點問題，仍不能完全正確反映出各種外源物在人胚胎發(fā)育過程中的毒性等級。本論文旨在一是建立有效的多分子終點法的胚胎干細胞試驗(embryonic stem cell test，EST)，對明確體內胚胎發(fā)育毒性的各種受試物進行研究評價;二是基于人誘導性多能干細胞(human inducedpluripotent stem cell，hiPSC)建立科學有效的篩選評價發(fā)育毒性的體外模型即人

2、誘導性多能干細胞試驗(human induced pluripotent stem cell test，hiPST);三是應用上述經證實有效可靠的發(fā)育毒性體外模型評價白藜蘆醇和甲殼低聚糖的發(fā)育毒性，為白藜蘆醇和甲殼低聚糖的應用提供詳實的發(fā)育毒性數(shù)據(jù)。
　　[方法]：
　　1.各種受試物設置不同濃度組，MTT法分別檢測各受試物不同濃度對3T3細胞、小鼠胚胎干細胞(Embryonic stem cell，ESC)、人皮膚成纖維細

3、胞(Humansapiens fibroblast cell，HSF)、hiPSC的細胞毒性，于490 nm處測量其吸光度OD值，并繪成濃度-反應曲線，求出相對應的產生細胞半數(shù)致死量的受試物濃度即IC503T3、 IC50HSF、IC50ESC、IC50hiPSC。
　　2.在含有受試物不同濃度的分化培養(yǎng)液中懸滴法培養(yǎng)ESC，懸浮法培養(yǎng)hiPSC，以形成擬胚體(Embryonic body, EB)，然后轉移EB至含有相同濃度受試

4、物的分化培養(yǎng)液中貼壁培養(yǎng)繼續(xù)分化，各濃度組EB數(shù)量相同。
　　3.分化第10天或者第15天時，Real-time PCR檢測受試物各濃度分化組細胞的特異基因表達，得到半數(shù)抑制分化的受試物濃度ID50值。
　　4.將三個終點IC503T3、IC50ESC、ID50ESC，另外三個終點IC50HSF、IC50hiPSC、ID50hiPSC代入特定函數(shù)公式計算，評價結果與各受試物體內發(fā)育毒性數(shù)據(jù)比較，判斷EST和hiPST是否成功

5、建立。
　　[結果]：
　　1.各受試物細胞毒性終點IC503T3、IC50ESC，胚胎毒性終點ID50ESC代入函數(shù)公式計算后，評價發(fā)育毒性結果分別為青霉素無毒性、糖精鈉無毒性，丙戊酸弱毒性、氯化鋰弱毒性，5-氟尿嘧啶強毒性、羥基脲強毒性，與體內胚胎發(fā)育毒性等級相符合。
　　2.IC50HSF、IC50hiPSC、ID50hiPSC代入函數(shù)公式計算后，評價發(fā)育毒性結果分別為青霉素無毒性、5-氟尿嘧啶強毒性。與體內胚胎

6、發(fā)育毒性等級相符合。
　　3.經EST和hiPST分別評價，白藜蘆醇和甲殼低聚糖均呈無毒性。
　　[結論]：
　　1.本實驗基于ESC建立的分子終點EST是有效的，且涵蓋了早中晚發(fā)育的多個早期胚胎發(fā)育階段終點。
　　2.本實驗基于hiPSC已建立科學有效的用于評價預測發(fā)育毒性的體外替代模型。
　　3.用EST和hiPST評價了白藜蘆醇和甲殼低聚糖的發(fā)育毒性，為白藜蘆醇和甲殼低聚糖的應用提供了準確可靠的發(fā)育毒