生命早期營(yíng)養(yǎng)不良誘導(dǎo)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)的表觀調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、生命早期（一般指胎兒期、嬰幼兒期）是生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期，這一階段正是機(jī)體各器官、組織、細(xì)胞分化形成和發(fā)育成熟時(shí)期;該階段可塑性強(qiáng)，多數(shù)器官和系統(tǒng)的發(fā)育在這個(gè)“時(shí)間窗”對(duì)環(huán)境敏感且易變，不良應(yīng)激可導(dǎo)致疾病的發(fā)生和發(fā)展的易感性增強(qiáng)。
　　據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球每年出生1200多萬早產(chǎn)兒，占新生兒總數(shù)的9.6％。按照我國目前的出生率和早產(chǎn)發(fā)生率計(jì)算，每年出生約150萬早產(chǎn)兒，占全球早產(chǎn)兒總數(shù)的十分之一以上。宮外生長(zhǎng)遲緩(Extraut

2、erine growth restriction，EUGR)指小兒出生后生長(zhǎng)發(fā)育計(jì)量指標(biāo)在相應(yīng)宮內(nèi)生長(zhǎng)速率期望值的第10百分位水平以下（≤生長(zhǎng)曲線的第10百分位）。EUGR在早產(chǎn)兒中發(fā)生率極高，問題十分突出。
　　大量的人群流行病學(xué)資料調(diào)查、前瞻性臨床研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，生命早期所處環(huán)境的不良刺激不僅影響出生前和出生后的生長(zhǎng)發(fā)育，而且會(huì)對(duì)成年后的健康和生活質(zhì)量產(chǎn)生遠(yuǎn)期乃至終生影響，此即成人疾病的胎兒起源假說(fetal o

3、rigins of adult disease，F(xiàn)OAD)和“發(fā)育起源的健康與疾病”(developmentorigin of Health and disease,DOHaD)學(xué)說。
　　越來越多的證據(jù)揭示了表觀調(diào)控機(jī)制在發(fā)育起源的健康與疾病中起到重要作用。表觀遺傳學(xué)是研究不涉及DNA序列改變的基因表達(dá)和調(diào)控的可遺傳修飾，包括DNA甲基化、組蛋白修飾、RNA干擾等。檢測(cè)DNA甲基化與組蛋白修飾的表觀遺傳學(xué)方法主要由染色質(zhì)免疫沉淀

4、技術(shù)，以及在經(jīng)過全基因組甲基化芯片芯片初步篩選后，Sequenom特定DNA段甲基化檢測(cè)技術(shù)對(duì)差異甲基化基因位點(diǎn)進(jìn)行技術(shù)驗(yàn)證。目前由于生命早期不良的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境相關(guān)的成人期肺部疾病發(fā)生的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制已經(jīng)有了初步的認(rèn)識(shí)，然而，由生命早期營(yíng)養(yǎng)受限所誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓中是否存在表觀遺傳調(diào)控尚不清楚。
　　鑒于現(xiàn)有的資料，我們假設(shè)
　　1.生命早期營(yíng)養(yǎng)受限可誘導(dǎo)肺血管功能相關(guān)的基因eNOS的表觀遺傳修飾的改變（DNA甲基化與組蛋白修飾

5、），并且可能存在性別的差異。
　　2.生命早期營(yíng)養(yǎng)受限所致的成年期肺動(dòng)脈高壓，存在著一系列相關(guān)基因的表觀遺傳修飾的改變。而且這些相關(guān)基因的早期表觀修飾改變可以引起個(gè)體成年期對(duì)外界刺激因素高度敏感，導(dǎo)致肺血管內(nèi)皮細(xì)胞功能調(diào)控紊亂，從而發(fā)生肺動(dòng)脈高壓。
　　這些表觀遺傳修飾改變可以引起個(gè)體對(duì)環(huán)境等刺激因素高度敏感，導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生。如果在個(gè)體發(fā)育早期階段給予適當(dāng)?shù)母纱胧?，阻止或逆轉(zhuǎn)相關(guān)基因的表觀修飾，可能對(duì)降低成年后發(fā)生肺動(dòng)

6、脈高壓有保護(hù)作用。
　　第一部分宮外生長(zhǎng)遲緩改變肺血管內(nèi)皮細(xì)胞eNOS的表達(dá)的表觀調(diào)控機(jī)制
　　目的:
　　大量的人群流行病學(xué)資料調(diào)查、前瞻性臨床研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，生命早期所處環(huán)境的不良刺激不僅影響出生前和出生后的生長(zhǎng)發(fā)育，而且會(huì)對(duì)成年后的健康和生活質(zhì)量產(chǎn)生遠(yuǎn)期乃至終生影響。此即“發(fā)育起源的健康與疾病”(development origin of Health and disease，DOHaD)學(xué)說。目前生

7、命早期不良的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境相關(guān)的成人期疾病發(fā)生的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制已經(jīng)有了初步的認(rèn)識(shí)，然而，由生命早期營(yíng)養(yǎng)受限對(duì)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用尚不清楚。肺血管內(nèi)皮細(xì)胞由內(nèi)皮型一氧化氮合成酶(eNOS)產(chǎn)生的一氧化氮(NO)在肺動(dòng)脈高壓的發(fā)病中有重要作用，而內(nèi)皮細(xì)胞eNOS的表達(dá)是受到表觀遺傳調(diào)控的。本研究的目的是探索在生命早期營(yíng)養(yǎng)不良(EUGR)模型中肺血管內(nèi)皮細(xì)胞中eNOS基因的表觀遺傳修飾的改變。
　　方法:
　　SD大鼠EUGR模型建立

8、，對(duì)哺乳期新生仔鼠進(jìn)行飲食限制，制備EUGR模型。正常對(duì)照組飼養(yǎng)模式:10只仔鼠/窩;EUGR組喂養(yǎng)模式:20只仔鼠/窩。生后21天離乳的雌雄SD大鼠，磁珠激活的細(xì)胞分選技術(shù)(MACS)分離獲得肺血管內(nèi)皮細(xì)胞(Pulmonary Vascular Endothelial Cell，PVEC)。Real-time PCR和Western blot用于檢測(cè)eNOS基因的mRNA和蛋白的表達(dá)水平;染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)和Sequenom特定DNA

9、段甲基化檢測(cè)技術(shù)用于分析eNOS基因的組蛋白修飾和DNA甲基化的表觀調(diào)控機(jī)制的變化。
　　結(jié)果:
　　EUGR模型評(píng)估:EUGR組SD大鼠哺乳期生長(zhǎng)速率明顯低于對(duì)照組，生后21天離乳時(shí)，體重與對(duì)照組相比明顯下降，降低30％左右。3周的EUGR組雌雄SD大鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞(PVEC)中，eNOS基因mRNA和蛋白水平明顯低于對(duì)照組;eNOS基因近端啟動(dòng)子區(qū)域的組蛋白H3K9met3和H3K27met3水平均高于正常對(duì)照組，雄性

10、SD大鼠H3K27met3增加更明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;雌性EUGR組的eNOS基因啟動(dòng)子DNA甲基化比對(duì)照組要高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;然而，雄性SD大鼠的eNOS基因啟動(dòng)子DNA甲基化程度，兩組之間無顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論:
　　生命早期飲食受限的EUGR模型對(duì)SD大鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞中的eNOS基因的表達(dá)有影響。eNOS mRNA和蛋白表達(dá)減少與該基因啟動(dòng)子區(qū)域的組蛋白“抑制性標(biāo)記物”H3K27met3水平增加密切相關(guān);雌性E

11、UGR組eNOS基因啟動(dòng)子區(qū)域的DNA高甲基化可能與eNOS mRNA表達(dá)減少有關(guān)。eNOS基因的表觀修飾改變與減少的eNOS基因mRNA和蛋白水平相一致。表觀遺傳調(diào)控可能是EUGR模型中肺血管內(nèi)皮細(xì)胞eNOS基因表達(dá)改變的機(jī)制之一，表觀遺傳調(diào)控的改變存在性別的差異。
　　第二部分宮外生長(zhǎng)遲緩誘導(dǎo)成年期肺動(dòng)脈高壓肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的表觀調(diào)控機(jī)制
　　目的:
　　生后早期是生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期，可塑性強(qiáng)，多數(shù)器官和系統(tǒng)的發(fā)育在

12、這個(gè)“時(shí)間窗”對(duì)環(huán)境敏感且易變，不良應(yīng)激可導(dǎo)致疾病的發(fā)生和發(fā)展的易感性增強(qiáng)。生命早期營(yíng)養(yǎng)不良不僅可以增加成年期代謝性疾病和心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，還可以導(dǎo)致肺血管張力改變、肺血管重構(gòu)，但引起肺血管功能失調(diào)的機(jī)制尚不十分清楚。EUGR在早產(chǎn)兒中發(fā)生率極高，問題十分突出。目前，生命早期營(yíng)養(yǎng)受限相關(guān)的成人期疾病發(fā)生的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制有了初步的認(rèn)識(shí)，有研究推測(cè)相關(guān)基因的DNA甲基化與組蛋白修飾異?？赡軈⑴c生命早期營(yíng)養(yǎng)干預(yù)導(dǎo)致的肺血管功能失調(diào)。

13、而且這些相關(guān)基因的早期表觀修飾改變可以引起個(gè)體成年期對(duì)等外界刺激因素高度敏感，導(dǎo)致肺血管張力調(diào)控紊亂，從而發(fā)生肺動(dòng)脈高壓。本實(shí)驗(yàn)的目的是為了探索EUGR導(dǎo)致的肺血管功能失調(diào)與DNA甲基化與組蛋白修飾異常改變的關(guān)系。
　　方法:
　　SD大鼠EUGR模型的建立。經(jīng)右側(cè)頸外靜脈進(jìn)行肺動(dòng)脈插管，測(cè)量生后9周EUGR雄性大鼠肺動(dòng)脈平均壓力。分離心臟組織，計(jì)算右心指數(shù)。對(duì)大鼠的肺組織進(jìn)行免疫組化染色，評(píng)價(jià)肺血管重構(gòu)情況。生后9周的雄S

14、D性大鼠，磁珠激活的細(xì)胞分選技術(shù)(MACS)分離獲得肺血管內(nèi)皮細(xì)胞。Western blot用于評(píng)估eNOS蛋白的表達(dá)，Real-time RT-PCR技術(shù)用于驗(yàn)證DNA甲基化異常調(diào)節(jié)基因的mRNA表達(dá)水平。染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)用于分析eNOS、IGF-1、PPARγ基因的組蛋白修飾改變。對(duì)分選的PVECs進(jìn)行全基因組DNA甲基化芯片(MeDIP)分析。Sequenom特定DNA段甲基化檢測(cè)技術(shù)對(duì)差異甲基化基因位點(diǎn)進(jìn)行技術(shù)驗(yàn)證。
　

15、　結(jié)果:
　　EUGR組雄性大鼠哺乳期到生后9周生長(zhǎng)速率均低于對(duì)照組。9周SD雄性大鼠肺血管功能失調(diào):肺動(dòng)脈平均壓增高，右心指數(shù)數(shù)值增加，免疫組化結(jié)果肺小動(dòng)脈發(fā)生重構(gòu)。DNA甲基化芯片分析:篩選出來EUGR組與Control組之間DNA甲基化差異表達(dá)基因的近500多個(gè)。Gene Ontology分析:這些發(fā)生高甲基化水平改變的基因多與血管發(fā)育相關(guān)。這些發(fā)生低甲基化水平改變的基因與分化相關(guān)和參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)為主。DNA甲基化芯片結(jié)果顯示

16、Fgfr2、RhoC、Notch1呈高甲基化狀態(tài)，F(xiàn)gfr2、RhoC、Notch1三個(gè)基因的mRNA表達(dá)水平表達(dá)降低。eNOS、PPARγ、IGF-1基因的mRNA表達(dá)與DNA甲基化狀態(tài)和組蛋白修飾的改變有關(guān)。
　　結(jié)論
　　宮外生長(zhǎng)遲緩(EUGR)模型雄性大鼠在成年期可出現(xiàn)肺血管功能失調(diào)，主要表現(xiàn)為肺動(dòng)脈平均壓力增高，右心指數(shù)增加，肺血管重構(gòu)。EUGR可導(dǎo)致成年期大鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)基因發(fā)生DNA甲基化異常改變。eNO