膽汁酸通過核受體FXR對胃癌抑制作用的研究.pdf

1、胃癌是世界上第二位高發(fā)、高致死率惡性腫瘤,也是我國最常見的惡性腫瘤之一。胃癌的發(fā)生發(fā)展是多個因素共同作用的結果,也是一個相當漫長的演變階段,可能與多種外部因素相關,在此作用下,個體遺傳素質改變,包括原癌基因的激活、抑癌基因的失活、端粒酶的激活、細胞骨架和黏附分子的改變、生長因子及其受體改變、DNA修復基因的異常和積累等,最后細胞異常增生,腫瘤形成并發(fā)生轉移。胃癌還與慢性胃炎、胃息肉、胃粘膜異形增生和腸上皮化生等有一定關系。
　　

2、 隨著分子生物學技術的發(fā)展,人們對胃癌發(fā)病機制的研究已經深入到分子水平,從中找出有價值的胃癌診斷標記物和治療靶分子是目前胃癌研究的重點和熱點。
　　 法尼酯衍生物X受體(FXR)是一種主要在肝及胃腸系統等組織器官表達的膽汁酸受體,屬于激素核受體超家族的一員,在膽汁酸代謝及膽固醇代謝中發(fā)揮重要作用。
　　 但FXR的作用遠不止于代謝調節(jié)?？偨Y目前關于FXR的研究,提示,FXR在膽汁淤積、肝腫瘤、消化道腫瘤等均有保護作用,但

3、其分子機制究竟為何,尚未有深入研究。本研究擬針對FXR在胃癌中的作用機進行初步探討,為FXR和胃癌的相互關系提供證據。
　　 第一章FXR在人正常胃、胃癌組織及人胃癌細胞株中的表達目的檢測FXR在正常胃/胃癌組織,及多種胃癌細胞株中的表達情況。
　　 方法
　　 1.收集德國慕尼黑工業(yè)大學伊薩河右岸醫(yī)院(Klinikum rechts der Isar der TUM)2002年～2008年住院部及門診病例,人正

4、常胃/胃癌組織標本,應用qPCR、westernblot、免疫組化方法檢測FXR在人正常胃/胃癌組織的表達模式。
　　 2.用qPCR和westernblot方法檢測人胃癌細胞株AGS、N87、Snu-1、Snu-5、KATO-Ⅲ、MKN7、MKN45中FXR的表達。
　　 結果
　　 1.FXR表達于人正常胃粘膜上皮,而在胃癌上皮中明顯下調或缺失。
　　 由免疫組化染色可見FXR主要位于非腫瘤性胃腺上皮

5、,核染色為主,還有部分陽性染色位于腺體周圍結締組織。對于胃癌組織,FXR陽性染色明顯減弱,且胞漿染色為主。
　　 選取30例胃癌患者及相應正常胃粘膜組織,qPCR分析顯示83.5％(25/30)患者mRNA水平在正常胃粘膜處于較高水平,胃癌組織中下調,具有顯著性差異。
　　 Westernblot分析可見FXR為一分子量為56kD蛋白,正常組織可見清晰強陽性條帶,腫瘤組織弱陽性或表達缺失。
　　 2.FXR在絕大

6、部分胃癌細胞株中缺失。
　　 qPCR分析顯示:胃癌細胞株AGS、Snul、Snu5、N87、KATO3、MKN7、MKN45中FXR的表達缺失,HepG2細胞作為陽性對照呈高表達。
　　 Westernblot顯示:FXR在所有胃癌細胞株中均缺失,肝組織作為陽性對照呈現濃黑條帶。
　　 結論
　　 1.FXR在正常胃粘膜表達,在胃癌組織下調或缺失。
　　 2.FXR在大多數人胃癌細胞株缺失。

7、r>　　 第二章異源性FXR增加AGS胃癌細胞株抗TNFα介導的凋亡作用
　　 目的
　　 以AGS細胞為代表,建立了FXR-WT/FXR—EV/FXR-DN質粒穩(wěn)定轉染的AGS克隆,通過一系列細胞學檢測,初步闡述FXR在AGS生物學行為上的分子機制。
　　 方法
　　 1.根據lipofectamineTM2000試劑盒標準方案構建穩(wěn)定表達FXR—WT(FXR野生型)/FXR—EV(FXR空載質粒)/

8、FXR—DN(FXR顯性失活)的AGS克隆。
　　 2.通過FXR配體鵝去氧膽酸(CDCA),及凋亡誘導劑TNFα+CHX處理AGS細胞,建立不同AGS克隆凋亡模型。
　　 3.MTT法繪制TNFα+CHX誘導的凋亡曲線。
　　 4.RT-qPCR鑒定FXR在AGS克隆的表達。
　　 5.Westerblot鑒定FXR在AGS克隆的表達及TNFα+CHX誘導AGS克隆凋亡Caspase-8/Caspase

9、-3/PARP的表達。
　　 6.熒光倒置顯微鏡檢測TNFα+CHX誘導凋亡的AGS細胞7.流式細胞儀檢測不同AGS克隆在TNFα+CHX誘導下的凋亡。
　　 8.RNA干擾結果1.成功建立FXR-WT/FXR-EV/FXR-DN穩(wěn)定轉染的AGS克隆細胞系,并用qPCR及westernblot檢測FXR在AGS克隆的穩(wěn)定表達。
　　 2.MTT法檢測FXR在AGS克隆的抗凋亡作用。無FXR配體CDCA共處理的凋亡

10、誘導,隨著TNFα+CHx濃度的增加,WT克隆存活率明顯大于EV克隆和DN克隆。有FXR配體CDCA共處理的凋亡誘導,以不同濃度TNFα+CHX處理AGS克隆24小時,隨著TNFα+CHX濃度的增加,可見WT克隆存活率明顯大于EV克隆和DN克隆,且WT克隆存活率較沒有CDCA共處理的WT克隆存活率更高。CDCA50uM能最大限度保護FXR—WT AGS細胞。
　　 3.根據前面結果,選擇TNFα100ng/ml+CHX20ug/

11、ml這一濃度,用westernblot觀察不同曝露時間下AGS克隆凋亡酶Caspase及其底物PARP的表達情況。FXR-EV/FXR-WT的凋亡產物都隨處理時間增加而增加,且FXR-EV克隆凋亡產物表達量較FXR-WT明顯增加。
　　 4.熒光倒置顯微鏡檢測Annexin-V-FLUOS染色的AGS FXR-WT/FXR-EV凋亡細胞。AGS克隆在用TNFα100ng/ml+CHX20ug/ml處理細胞24小時,誘導產生凋亡細

12、胞,采用Annexin-V-FLUOS/PI雙染色,并用熒光倒置顯微鏡鏡檢,確認AGS FXR—EV較AGS FXR—WT出現更多凋亡細胞。
　　 5.流式細胞儀計數AGS FXR-WT/FXR-EV凋亡細胞。精確計數AGSFXR-WT/FXR—EV細胞在TNFα+CHX誘導下凋亡程度的差別,利用流式細胞儀,采取Annexin-V-FLUOS/PI雙染色,計算(凋亡細胞/50000細胞)比率,發(fā)現FXR-EV細胞較FXR—WT細

13、胞出現更多凋亡細胞,具有顯著性差異。
　　 6.MTT法檢測siRNA干擾的AGS FXR-WT克隆凋亡情況。運用RNA干擾技術處理AGS FXR—WT克隆,沉默FXR基因,經檢測,基因沉默效果較好,經過RNA干擾,FXR基因沉默的AGS FXR.WT克隆凋亡率明顯高于未經過干擾的AGS FXR-WT克??；在兩者經過同樣的FXR配體CDCA處理以后,CDCA在未經干擾的AGS FXR-WT克隆顯示出其對凋亡的保護作用,而在FXR

14、基因沉默的克隆未顯示出相似作用。
　　 結論
　　 1.通過建立穩(wěn)定轉染FXR-WT/FXR-EV/FXR-DN的AGS克隆,可以研究0FXR在胃癌細胞株中的生物學行為。
　　 2.異源性FXR在AGS胃癌細胞株中有抗TNFα+CHX誘導凋亡的作用,這一作用有可能減少炎癥引起的細胞損傷,起遠期抑癌作用。
　　 第三章FXR的激活上調靶基因CK13的表達
　　 目的
　　 應用基因芯片技術篩

15、選出可能介導FXR抗凋亡的基因CK13,并從mRNA和蛋白水平上確認了FXR激活對CK13的上調作用。檢測了人正常胃/胃癌組織CK13的表達,并以胃癌細胞株AGS和FXR—KO小鼠為模型,從體內外兩方面闡述了FXR對CK13基因的結合和轉錄調控。
　　 方法
　　 1.AGS克隆基因表達譜的基因芯片分析,根據Affymetrix GeneChip(R)GeneExpression Analysis Technical M

16、anual標準方案。
　　 2.RT-qPCR鑒定CK13在AGS克隆、小鼠胃組織、人正常胃/胃癌組織中的表達。
　　 3.westerblot鑒定CK13在AGS克隆、小鼠各器官組織、人正常胃/胃癌組織中的表達。
　　 4.CK13在FXR-WT/FXR-KO小鼠胃組織的免疫組化染色。
　　 5.ChIP,根據ChIP Assay Kit(Upstate)標準方案。
　　 6.EMSA
　

17、　 結果
　　 1.基因芯片表達譜分析及挑選介導FXR激活抗凋亡作用的候選基因以CDCA100uM/DMSO處理AGS FXR—WT/FXR-EV16小時后,根據基因芯片分析結果挑選出FXR候選靶基因CK13。
　　 2.FXR激活誘導CK13表達上調2.1基因芯片FXR依賴基因表達譜變化的qPCR分析作為FXR的經典靶基因OSTalpha和IBABP,經FXR配體CDCA刺激后,AGS FXR-WT都有不同程度的上調

18、,而AGS FXR—EV/AGS FXR—DN則基本沒有變化,HepG2是陽性對照。由此可確知FXR依賴性的CDCA的配體激活作用。經qPCR檢測,CDCA誘導AGS FXR—WT中CK13的上調與基因芯片的結果吻合。
　　 2.2 CDCA通過FXR上調AGS FXR-WT細胞CK13表達是濃度依賴性CDCA處理AGS克隆24d小時,濃度分別為0,25,50,75,100uM。經qPCR檢測,AGS FXR—WT細胞呈現明顯的

19、CK13 mRNA上調,呈CDCA濃度依賴性,而AGS FXR-EV/FXR-DN細胞無明顯變化。經westernblot檢測,AGS FXR-WT細胞呈現明顯的CK13蛋白上調,呈CDCA濃度依賴性,而AGS FXR-EV/FXR-DN細胞無明顯變化。
　　 2.3 CDCA通過FXR在小鼠胃組織上調CK13 mRNA表達為進一步探討CDCA通過FXR誘導的CK13在體內的表達模式,用含有(1％CDCA+Zn)的飼料喂養(yǎng)C57

20、BU6野生型(n=5)和FXR-KO小鼠(n=5)7天及8周,提取其胃組織mRNA,經qPCR檢測,發(fā)現CK13 mRNA在C57BL/6野生型表達上調,短期(7天)或長期(8周)有相似反應,短期反應更顯著,但在FXR-KO小鼠基本沒有改變。除此之外,對小鼠其他器官如肝、食管和結腸FXR經典靶基因的qPCR檢測(SHP、Cyp7A、IBABP等)顯示,Cyp7A在肝外器官低表達,且對CDCA刺激無反應；但IBABP在C57BL/6野生型

21、小鼠結腸、食管和胃的表達顯著性上調,在FXR-KO小鼠無改變,顯示出CDCA可以引發(fā)系統性的肝外的FXR依賴反應。
　　 3.CK13在C57BL/6野生型和FXR-KOd,鼠器官的表達模式為了觀察CK13在小鼠其他器官的表達模式是否與FXR相關,我們檢測了C57BL/6野生型和FXR-KO小鼠不同器官的CK13 mRNA和蛋白水平。CK13在C57BL/6野生型小鼠各器官均有表達,在FXR-KOd小鼠低表達或缺失。免疫組化染色

22、顯示胃腺和胃食管連接處鱗狀上皮的CK13陽性染色。CK13主要表達于胃上皮細胞周圍的纖維母細胞,提示其作為細胞骨架蛋白,在細胞連接、穩(wěn)定的作用。
　　 4.CK13在人正常胃/胃癌組織中的表達在確認胃癌細胞株和FXR-KO小鼠CK13下調以后,接下來的實驗檢測了CK13在人正常胃/胃癌組織中的表達。并在mRNA、蛋白水平闡明,CK13與FXR的變化模式一致,表達于正常胃黏膜上皮,在胃癌組織中下調或缺失。
　　 qPCR結

23、果顯示:CK13 mRNA在胃癌組織下調,與正常胃黏膜相比有顯著性差異,在30病例中,80％(24/30)符合上述模式。
　　 westernblot檢測:從代表性病例中可見,CK-13蛋白表達與m RNA的趨勢一致,在人正常胃組織中高表達,在胃癌組織下調或缺失。
　　 免疫組化顯示:CK13典型陽性染色為細胞內網狀結構,因其為細胞內的中等纖維,故在呈現為細胞骨架。在彌漫性胃癌組織內,CK13陽性染色減弱。值得一提的是,

24、在腸上皮化生的示范染色中,可見殘留正常腺體CK13染色陽性,而在化生病灶中,CK13染色陰性,充分說明在正常至癌變的過渡中,CK13趨向于下調。
　　 5.CK13的定量ChIP在本實驗中,應用FXR多抗(H-130,Santa Cruz Biotech)作為抗體,CK13的DNA純化片段用qPCR擴增,CT值用b2m標化,直接比較AGS FXR—WT/FXR—EV的免疫沉淀產物。qPCR產物并用瓊脂糖電泳顯示。AGS FXR-

25、WT克隆CK13基礎表達量較AGS FXR—EV克隆CK13基礎表達量高,且經過FXR配體CDCA刺激后,AGS FXR-WT克隆CK13表達量明顯上調,而AGS FXR—EV克隆無明顯變化。
　　 6.熒光素酶活性檢測我們將含有CK13啟動子的報道基因CK13 promoter pGL3-basic—luciferasevector或FXR-RE pTK-luc和FXR—WT或EV共轉染入HEK293細胞,并用50μM和100

26、μM CDCA處理24小時后觀察熒光素酶活性的變化。CDCA處理FXR-WT轉染的HEK293細胞后引起CK13啟動子pGL3-luc的熒光素酶活性明顯升高,而EV轉染的HEK293細胞在CDCA處理后報道基因熒光素酶的表達未見明顯變化,作為陽性對照,FXR-REpTK-luc轉染的HEK293細胞內的熒光素酶活性在FXR激活后呈CDCA濃度依賴性的升高。
　　 7.MTT法檢測CK13 siRNA干擾的AGS FXR—WT克隆

27、凋亡情況為進一步明確CK-13在AGS克隆凋亡中所起的作用,我們運用RNA干擾技術處理AGS FXR-WT克隆,沉默FXR基因。圖3-13右側的小圖(qPCR產物瓊脂糖電泳)顯示RNA干擾的效能,RNAi處理的克隆CK13表達明顯減弱。
　　 經過CK13 RNA干擾,CK13基因沉默的AGS FXR—WT克隆凋亡率明顯高于未經過干擾的AGS FXR-WT克??；在兩者經過同樣的FXR配體CDCA處理以后,CDCA在未經干擾的AG

28、S FXR-WT克隆顯示出其對凋亡的保護作用,而在CK13基因沉默的克隆未顯示出相似作用。
　　 8.EMSA檢測FXR在CK13基因上的結合位點我們應用EMSA檢測FXR是否直接與CK13基因元件結合。FXR-WT質粒轉染HEK293細胞后,首先應用western blotting確認了轉染和核蛋白的提取的成功。經過分析,我們篩選出一些FXR在CK13基因上的可能結合位點,即VDR和RARE—1,2,3。
　　 EMS

29、A的結果顯示,與未轉染的HEK293細胞相比,轉染了FXR-WT質粒的HEK293細胞的核蛋白對FXR IR-1寡核苷酸探針的結合明顯增加,此結合被200倍過量的未標記RARE-3寡核苷酸探針顯著競爭抑制,而200倍過量的未標記寡核苷酸探針RARE-3(MUT)未引起結合的顯著降低。
　　 結論
　　 1.胃癌AGS細胞株及小鼠、人胃組織CK13基因的表達上調依賴于FXR的激活。
　　 2.FXR激活可能通過CK