抗人DR5單抗誘導Jurkat和U937細胞凋亡機制研究.pdf

1、背景:腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體(tumor necrosis factor-relatedapoptosis-inducing ligand，TRAIL)發(fā)現(xiàn)于1995年，是腫瘤壞死因子超家族的一員，它因能夠特異性地誘導腫瘤細胞凋亡而對大多數(shù)正常細胞沒有毒性而備受人們的關注。TRAIL的生物學效應是通過與細胞膜上的相應受體結合啟動內源和外源性信號傳導途徑而產生的。DR4(TRAIL-R1)和DR5(TRAIL-R2)是TRAIL的

2、死亡受體，其與TRAIL結合能夠傳導凋亡信號，誘導腫瘤細胞凋亡。雖然TRAIL有良好的抗腫瘤作用，但研究發(fā)現(xiàn)某些版本的rTRAIL對正常肝細胞有毒性作用，使人們對其生物安全性產生了懷疑。研究發(fā)現(xiàn)一些抗DR4和DR5的單克隆抗體(mAb)能夠模擬TRAIL誘導腫瘤細胞凋亡的作用且無肝細胞毒性，因此研制抗人DR4和DR5的功能性單克隆抗體(mAb)成為TRAIL腫瘤生物治療的有效替代品，此類的單抗已初步顯示出了在癌癥治療方面的潛力。我們在實

3、驗中篩選出了一個新的小鼠抗人DR5單抗mDRA-6，該抗體在體外無交聯(lián)劑的條件下能夠誘導多種腫瘤細胞凋亡，而且表現(xiàn)出很好的體內腫瘤殺傷活性。 目的:探討抗人DR5單抗mDRA-6誘導Jurkat和U937細胞凋亡機制。 方法:瓊脂糖凝膠電泳檢測Jurkat和U937細胞DNA的片段化降解；MTT法檢測mDRA-6對Jurkat和U937細胞生長抑制作用；Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞儀定量分析技術檢測細胞

4、凋亡；免疫印跡技術(Western blotting)檢測細胞相關凋亡蛋白的激活情況；免疫沉淀法和銀染法檢測細胞DISC復合物：RT-PCR法檢測Jurkat和U937細胞DR5、Caspase-8和Caspase-10 mRNA的表達情況。 結果:1.10μg/ml的mDRA-6作用Jurkat和U937細胞6h后，瓊脂糖凝膠電泳顯示DNA片段化降解，表現(xiàn)為梯形DNA電泳條帶，預先用Caspase抑制劑干預后mDRA-6作用J

5、urkat和U937細胞，無明顯DNA梯形電泳條帶顯示。 2.MTT結果表明，10μg/ml的mDRA-6作用Jurkat和U937細胞2h后凋亡率分別為59.97％和42.38％；應用Caspase-8和Caspase-10抑制劑干預后，mDRA-6致Jurkat細胞死亡率分別降低45.32％(P<0.05)和4.52％(P>0.05)；mDRA-6致U937細胞死亡率分別降低4.33％(P>0.05)和30.36％(P<0.

6、05)。 3.Annexin V- FITC/PI雙染流式細胞儀檢測10μg/ml的mDRA-6作用Jurkat和U937細胞2h，細胞凋亡率分別為62.62％和35.65％；預先用廣譜Caspase-8抑制劑、Caspase-10抑制劑、Caspase-9抑制劑和Caspase抑制劑Z-VAD-FMK干預，mDRA-6致Jurkat細胞凋亡率分別減少45.87％、4.33％、46.44％和42.75％，mDRA-6致U937細

7、胞凋亡率分別減少0.89％、11.67％、2.33％和1.57％。預先用JNK抑制劑和NF-кB抑制劑干預，mDRA-6致Jurkat細胞凋亡率分別增加10.63％和5.14％，mDRA-6致U937細胞凋亡率分別增加26.67％和21.1％。 4.免疫印跡技術檢測顯示，mDRA-6作用Jurkat和U937細胞不同時間后提蛋白，Jurkat和U937細胞Caspase-3、-9、PARP、P-38、Bax、Bcl-2、Bcl-

8、xL均有激活表現(xiàn)：而Caspase-8僅在Jurkat細胞有激活顯示，Caspase-10僅在U937細胞有激活顯示；Caspase全抑制劑干預后，Jurkat和U937細胞Caspase-3、-9及PARP的激活片段被抑制；此外Jurkat和U937細胞子mDRA-6作用5min后JNK呈現(xiàn)活性片段表達，并隨mDRA-6作用時間的延長其活性增強；Caspase全抑制劑干預后，mDRA-6作用5min、15minJNK磷酸化增強，但隨m

9、DRA-6作用時間的延長，JNK磷酸化逐漸減弱。 5.免疫沉淀法結果顯示，與裸細胞組相比較，mDRA-6作用U937細胞后有Caspase-10的特異條帶出現(xiàn)，而mDRA-6作用Jurkat細胞后沒有Caspase-10的特異條帶出現(xiàn)。 6.RT-PCR法檢測發(fā)現(xiàn)，U937細胞Caspase-10 mRNA表達高于Jurkat細胞，而Jurkat和U937細胞DR5和Caspase-8 mRNA表達無明顯差異。

10、結論:1.mDRA-6能夠誘導人白血病Jurkat和U937細胞凋亡，其機制是主要激活死亡受體信號傳導途徑；Jurkat激活起始Caspase-8誘導細胞凋亡，U937細胞激活起始Caspase-10誘導細胞凋亡。Jurkat和U937細胞通過不同的起始Caspase誘導凋亡，可能與U937細胞Caspase-10 mRNA表達明顯高于Jurkat細胞有關。 2.mDRA-6誘導白血病細胞凋亡過程中有JNK和NF-кB的激活并且