IKKε在人腦膠質(zhì)瘤中的表達與其促膠質(zhì)瘤細胞增殖及侵襲的分子機制研究.pdf

1、膠質(zhì)瘤是最棘手的難治性腫瘤之一，盡管神經(jīng)外科手術、放療和化療的發(fā)展對膠質(zhì)瘤的治療起了重要的推動作用，但療效并不理想，預后仍然不良[1]。尤其是惡性膠質(zhì)瘤(GBM)，因其高增殖及侵襲性生物學特性，雖經(jīng)以手術為主聯(lián)合放射及化學治療，但預后并沒有得到明顯改善。平均存活時間只有12-15個月[2]，其中多形性膠質(zhì)母細胞瘤(glioblastomamultiforme，GBM)患者，尤其是老年患者，生存期不足1年[3]。如何控制膠質(zhì)瘤的惡性增殖和

2、侵襲是目前研究的焦點。目前已認識到，膠質(zhì)瘤是一種多基因異常疾病，分子發(fā)生機制復雜，涉及多種細胞信號通路中細胞因子的異常表達[4]。因此尋找導致膠質(zhì)瘤發(fā)病相關的基因，深入了解膠質(zhì)瘤的致病機理，進一步開拓膠質(zhì)瘤治療的新策略和靶點，成為膠質(zhì)瘤研究領域的一項重要內(nèi)容。
　　近年來，RNA干擾技術迅速發(fā)展，為膠質(zhì)瘤靶標研究提供了新思路。它不僅可以用于尋找與增殖、侵襲相關的靶標，更可以作為潛在的治療手段，為膠質(zhì)瘤靶向治療提供強有力干預治療。I

3、KK/NF-KB通路是一個重要的癌細胞存活的信號通路[5]。該通路中NF-KB的激活涉及IKB(NF-KB抑制劑)的磷酸化，而后者有賴于IKK(IKB激酶)的調(diào)控。IKB激酶家族(kinases，IKKs)作為NF-кB信號途徑的關鍵成員，能磷酸化IKB上的特定位點，從而使IкBα泛素化并最終被蛋白酶體降解，解除IKB對NF-KB的抑制。游離的NF-KB從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移入細胞核，激活參與應激反應和免疫細胞活化、增殖、分化、凋亡及腫瘤形成等相關

4、的400多種基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控[6-8]。IKKε作為IKK家族新近發(fā)現(xiàn)的成員，在眾多腫瘤中被確認高表達且在它們的惡性轉(zhuǎn)化中起著重要作用。并且多數(shù)研究已經(jīng)證實IKKε可以活化NF-KB通路是其致癌的重要機制。細胞實驗及動物實驗發(fā)現(xiàn)敲低IKKε對如乳腺癌[9]，卵巢癌[10]、前列腺癌[11]等細胞有顯著的抑癌作用，然而對IKKε在膠質(zhì)瘤中的表達以及作用機制研究甚少。我們前期研究檢測了9個膠質(zhì)瘤細胞系(D32，D37，M067，H4，U138

5、，U251，U87，U373，TP483)、3例正常腦組織和10例膠質(zhì)瘤標本中IKKε表達，結(jié)果提示IKKε在大多數(shù)膠質(zhì)瘤細胞系(僅TP483無IKKε表達)和膠質(zhì)瘤標本中過表達，而同時在正常腦組織(3例)中幾無表達。這些結(jié)果初步提示IKKε在膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著類似于乳腺癌中癌基因的作用。我們認為這些發(fā)現(xiàn)為進一步研究膠質(zhì)瘤分子病理的致病機制提供了重要的線索，因此有必要對膠質(zhì)瘤中IKKε/NF-KB通路在膠質(zhì)瘤增殖和侵襲中的作用進行

6、進一步研究。
　　本課題第一部分應用RT-PCR的方法檢測51例膠質(zhì)瘤臨床標本和7例正常腦組織以及7個細胞系IKKε的mRNA表達，應用免疫組化方法和蛋白印跡方法檢測了IKKε基因在蛋白水平的表達。并研究IKKε表達與膠質(zhì)瘤惡性程度之間的相關性。
　　第二部分在體外應用RNA干涉技術以oligofectamine介導siRNA靶向IKKε轉(zhuǎn)染人腦膠質(zhì)母細胞瘤U251和LN229細胞后，應用realtime PCR和蛋白印跡檢

7、測目的基因和蛋白水平的敲低情況，采用細胞周期、MTT、細胞平板克隆實驗檢測敲低IKKε后的細胞增殖能力；采用劃痕試驗、侵襲試驗檢測細胞的遷移和侵襲能力，應用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。應用蛋白印跡和PCR分別檢測了NF-KB通路中涉及增殖、侵襲、凋亡有關的蛋白，應用細胞免疫組化，細胞免疫熒光分別檢測了敲低IKKs后NF-KB的細胞轉(zhuǎn)座情況。分別提取細胞漿和細胞核內(nèi)NF-KB組分P65應用蛋白印跡進一步驗證轉(zhuǎn)染IKKε siRNA后NF-

8、KB的向細胞核轉(zhuǎn)座情況。
　　第三部分中則通過建立建立U251裸鼠皮下荷瘤模型，瘤內(nèi)注射oligofectamine和siRNA的混合物，每2天測量一次腫瘤體積，動態(tài)觀察腫瘤生長情況，檢測RNA干涉技術敲低U251裸鼠膠質(zhì)瘤IKKε的表達后NF-KB通路主要成員的表達變化，對體外實驗的結(jié)果進一步驗證。免疫組化法檢測腫瘤標本的相關蛋白表達情況分析可能的抑癌機制。
　　結(jié)果：
　　1.第一部分腫瘤標本顯示40/51例IKK

9、ε有表達，Ⅲ/Ⅳ級中23/27例中/高表達。且和腫瘤級別呈正相關。同時還檢測到4/7細胞系中IKKε過表達。膠質(zhì)瘤IKKε表達強度隨腫瘤惡性程度增加而增加。
　　2.第二部分結(jié)果表明IKKε siRNA可有效敲低IKKε在膠質(zhì)瘤細胞系U251和LN229細胞內(nèi)的表達，細胞流式示細胞周期SPF下降，G0/G1阻滯，MTT法證實細胞增殖受抑制。且細胞的侵襲和遷移能力明顯降低；敲低IKKε后細胞中IкBα水平升高，NF-KB向細胞核的轉(zhuǎn)

10、座明顯減少。然而，本實驗顯示IKKε似乎和凋亡無顯著相關。
　　3.第三部分成功構(gòu)建裸鼠皮下膠質(zhì)瘤模型，IKKε siRNA組顯示腫瘤生長速度減慢，體積變小。免組化結(jié)果表明靶向IKKε siRNA組較無義siRNA組NF-KB通路下游增殖侵襲指標的表達下調(diào)。
　　結(jié)論：
　　1.IKKε在人腦膠質(zhì)瘤中過表達，和腫瘤病理分級正相關，可能參與膠質(zhì)瘤的進展。
　　2.IKKε促進膠質(zhì)瘤惡性進展是通過IкB/NF-KB通