新基因Ercc61在P19胚胎癌細胞內(nèi)的表達研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、研究目的：探討基因Ercc61在P19胚胎癌細胞及P19分化細胞中的表達情況，并構(gòu)建Ercc61的正、反義真核表達載體，在細胞學水平對基因功能進行初步研究。 研究方法：用一定濃度的二甲亞砜(DMSO)和維甲酸(RA)分別誘導處理P19胚胎癌細胞，使其分別向心肌細胞方向和神經(jīng)細胞方向分化，提取P19細胞總RNA，RT-PCR檢測P19細胞誘導分化前后Ercc61 mRNA的表達變化。用限制性內(nèi)切酶Xho Ⅰ和Kpn Ⅰ雙酶切含目的

2、基因的pGEM-T-Ercc61載體，獲得目的基因Ercc61序列，將其插入到真核表達載體pcDNA3.1(+)和pcDNA3.1(-)Myc His6多克隆位點的Xho Ⅰ和Kpn Ⅰ的酶切位點，相連構(gòu)成基因表達質(zhì)粒。將重組后的質(zhì)粒進行細菌轉(zhuǎn)化，先菌落PCR鑒定，然后質(zhì)粒擴增、純化后，再限制性內(nèi)切酶Xho Ⅰ和Kpn Ⅰ酶切鑒定。以脂質(zhì)體介導的方法體外瞬時轉(zhuǎn)染正義載體至P19細胞，RT-PCR檢測基因在細胞內(nèi)的表達活性情況，并用MTT

3、法測定轉(zhuǎn)染后細胞增殖活性變化。聯(lián)合化療藥物順鉑處理P19細胞，MTT比色法檢測藥物對細胞凋亡的影響，同時分析用順鉑處理P19細胞后，Ercc61mRNA的表達變化。 研究結(jié)果：RT-PCR檢測表明，基因Ercc61在P19胚胎癌細胞中不表達，DMSO和RA分別誘導處理P19細胞后，在誘導期及向心肌細胞方向和神經(jīng)細胞方向分化的細胞中均檢測到Ercc61 mRNA表達活性；化療藥物順鉑處理P19細胞未觀察到Ercc61基因表達的變化

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