內質網氧化應激在自然流產中的作用.pdf

1、背景： 自然流產(spontaneous abortion)是指妊娠不足20周，胎兒體重不足500g而終止者。前期我們利用蛋白質組學方法檢測自然流產患者蛻膜組織中蛋白質的表達，發(fā)現一些抗氧化物酶，參與內質網應激(endoplasmic reticulum stress,ER stress)的葡萄糖調節(jié)蛋白 78 (glucose regulated protein，GRP78)、含纈酪肽(valosin-containing p

2、rotein，VCP)以及泛素-蛋白酶體通路(ubiquitin-proteasome pathway，UPP)的兩個成員表達均發(fā)生顯著性變化(數據尚未發(fā)表)，提示自然流產的發(fā)病可能有尚不為人知的機制參與。是否母胎界面的氧化應激、ER．stress和UPP三者之間存在某種聯系，從而導致自然流產的發(fā)生，至今尚未有相關報道。 眾所周知，氧化應激是指活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成和抗氧化防御系統之

3、間的不平衡狀態(tài)。這種不平衡狀態(tài)可在ROS的生成超過抗氧化防御系統或抗氧化劑活性降低或減少時發(fā)生。過量的：ROS可使磷脂中的不飽和脂肪酸生成過氧化脂質，損傷生物膜：可以抑制蛋白質功能；破壞核酸及染色體，從而傷害機體的各種組織和細胞。 研究發(fā)現，氧化應激等可通過引起內質網攝取/釋放Ca2+障礙或蛋白質加工/運輸障礙，導致內質網腔內積累大量的未折疊/錯誤折疊蛋白質而誘發(fā)ER stress，又稱未折疊蛋白反應(unfolded prot

4、ein response，UPR)。內質網是真核細胞中蛋白質折疊和裝配的場所，對細胞內的蛋白質穩(wěn)態(tài)平衡非常敏感。ER stress引起包括編碼內質網伴侶蛋白在內的一系列基因(如GRP78)表達增加，通過抑制蛋白質翻譯，促進蛋白質正確折疊，減少蛋白質在內質網腔堆積，從而對細胞起保護作用。GRP78是ER stress的典型分子標記。那些最終不能達到正確折疊狀態(tài)的蛋白質被逆轉回胞質中，通過蛋白酶體降解。這種異常蛋白質在胞質中的降解，稱為內質

5、網相關性蛋白降解(endoplasmic reticulum associated degradation，ERAD)。該降解機制由LJPP所介導。在這些蛋白質的逆轉過程中，VCP發(fā)揮了重要作用。VCP是反常折疊蛋白的識別因子和病理效應器，是ERAD所需的細胞質內分子伴侶，陪伴底物從內質網逆轉到細胞質中，通過LJPP降解。VCP也是UPP降解過程中多泛素(Ubiquitin，Ub)鏈上的標記因子，在此途徑中作為一個普遍存在的分子伴侶來標

6、記多種底物，到蛋白酶處降解。VCP的缺失會導致UPP途徑的抑制和泛素化蛋白的蓄積。 UPP是ATP依賴的蛋白質選擇性降解的主要途徑，是真核細胞內重要的蛋白質質控系統，能夠高選擇性地降解細胞在應激和非應激狀態(tài)下產生的蛋白質，其底物包括氧化損傷、突變的、異常的或短命的蛋白質、錯誤折疊或錯誤定位的蛋白質，轉錄因子等許多調控蛋白質，對維持細胞的穩(wěn)態(tài)具有十分重要的意義。 另外，母體內的孕激素水平及孕激素受體(progesterone re

7、ceptor，PR)在著床部位組織細胞中的表達，對受孕及維持妊娠的微環(huán)境具有極其重要的作用。孕激素是維持早期妊娠唯一必需的甾體激素，在女性生殖活動中起重要作用，該生理作用主要是通過與PR結合來調節(jié)的。PR與孕激素結合后會受到胞內泛素蛋白的降解，UPP是其降解的主要通路。自然流產母胎界面PR蛋白表達是否異常，國內外文獻報道不一。多數學者觀察到正常早孕婦女蛻膜組織中PR表達高于流產患者，認為低PR表達是不明原因早期流產的病因，但也有文獻報道

8、兩者著床部位PR檢出率無統計學差異，對此本實驗也進行了相關研究。 本研究采用免疫組織化學二步法對Ub、GRP78、VCP和PR在正常早期妊娠和自然流產患者蛻膜組織的表達進行組織學定位；采用western blot方法檢測上述四個指標在兩組蛻膜組織中的表達差異，推測它們之間的相關性以及與自然流產的關系；利用過氧化氫(hydrogen dioxide，H2O2)建立正常早期妊娠蛻膜細胞的氧化模型，模擬母胎界面的高氧環(huán)境，并用MG13

9、2(UPP特異性抑制劑)阻斷UPP途徑，采用MTT方法檢測細胞活性，免疫細胞化學和western blot方法檢測Ub、GRP78、VCP、PR在處理后蛻膜細胞中的表達，檢測氧化應激是否通過引起ER stress和UPP途徑功能異常造成細胞損傷，導致自然流產的發(fā)生，從而為自然流產的病因做出新的解釋。 材料與方法： 1.選取臨床和B超診斷為難免流產的婦女，于門診手術室行吸宮術時，取其蛻膜組織作為病例組(n=20)；隨機選取

10、門診正常早孕要求人工流產的婦女，取其蛻膜組織作為正常組(n=20)。分別采用western blot方法進行Ub、GRP78、VCP和PR蛋白檢測，對western blot結果進行半定量分析。另隨機選取病例組和正常組各4例，采用免疫組織化學二步法對上述四個目的蛋白進行組織學定位。 2.隨機選取門診正常早孕要求人工流產的婦女6例，在離體子宮蛻膜細胞培養(yǎng)基礎上，MTT法測定不同濃度的H2O2和MG132作用12h后蛻膜細胞的活性，

11、利用測得的OD值繪制細胞存活曲線。同時采用western blot方法檢測其Ub、GRP78、VCP和PR蛋白的表達；免疫細胞化學方法進行上述四個目的蛋白的定位研究，并用人胎盤催乳素(human placental lactogen，HPL，)鑒定蛻膜細胞。 計量資料用平均數士標準差(X±SD)表示，采用兩個獨立樣本非參數檢驗，Mann-Whitney U檢驗進行兩組間數據比較分析，檢驗水準α=0.05，雙側。所有實驗數據用SP

12、SS150統計軟件包進行處理。 結果： 1.Ub、GRP78、VCP和PR蛋白在蛻膜組織的相對表達量Ub在病例組蛻膜組織的相對表達量為5.93+2.59，正常組中為4.04±1.64，樣本非正態(tài)分布，方差不齊，采用兩個獨立樣本非參數檢驗，Mann-Whitney U檢驗，P<0.05，差異具有統計學意義，病例組的表達明顯高于正常組；GRP78、VCP和PR在病例組蛻膜組織的相對表達量分別為0.77+0.5、0.67~0.

13、21、0.664-0.3，正常組中分別為1.1±0.57、1.32±0.91、1.124-0.76，樣本非正態(tài)分布，方差不齊，采用兩個獨立樣本非參數檢驗，Mann．．‘Whitney U檢驗，P<0.05，差異具有統計學意義，病例組的表達明顯低于正常組。 2.Ub、GRP78、VCP和PR蛋白在蛻膜組織的定位Ub主要表達于蛻膜組織上皮細胞的胞漿和胞核，間質中有少量表達：GRP78和VCP表達于蛻膜組織腺上皮和間質細胞的胞漿；PR

14、僅表達于間質細胞的胞核。光學顯微鏡下觀察，與正常組比較，病例組中Ub表達增加，而VCP、GRP78和PR表達減少。 3.不同處理因素對蛻膜細胞的影響本研究采用不同濃度的H202、MG132與蛻膜細胞共培養(yǎng)12h后，對其活性進行分析。隨H2O2濃度增大細胞活性逐漸下降，2000μm/L以上濃度的H2O2細胞活性幾乎無差別，均極低。測得對照組OD值為0.265～0.009：2.51μm/5μm/LMGl32 OD值分別為0.258±

15、0.014，0.238±0.019：2000/4000/8000μm/LH202OD值分別為0.018±0.004，0.02±0.006，0.02±0.002；2.5μm/LMG132＋2000/4000/8000μm/LLH2O2 OD值分別為0.018±0.003，0.019±0.004，0.027±0.005。 4.Ub、GRP78、VCP和PR蛋白在處理后蛻膜細胞的定位與免疫組織化學結果相類似，Ub定位于蛻膜細胞漿和胞核

16、，GRP78和VCP定位于胞漿，PR定位于胞核。光學顯微鏡下觀察，與未經H2O2處理的蛻膜細胞相比，H2O2處理后Ub、GRP78表達增高，VCP表達降低而PR表達無明顯變化。HPL免疫染色示95％以上的蛻膜細胞均陽性。 5.Ub、GRP78、VCP和PR蛋白在處理后蛻膜細胞的相對表達量與對照組比較，2.5μm/5μm/LMG132處理的細胞，Ub和GRP78的表達逐漸增加，VCP、PR無明顯變化；2000μm/L、4000μm

17、/L和8000μm/LH2O2處理后，Ub和GRP78的表達逐漸增加，VCP在8000μm/LH2O2處理組表達減少，PR均無明顯變化；2.5μm/LMG132+2000/4000/8000/LH202處理后，Ub、VCP、GRP78和PR均無明顯變化。 結論： 1.內質網應激參與自然流產的病理生理機制。 2.母胎界面的氧化應激可誘導內質網應激的發(fā)生，從而促進自然流產的發(fā)生。 3.氧化應激和內質網應激引起