產氫—產乙醇細菌群落結構與功能研究.pdf

1、有機廢水發(fā)酵法生物制氫技術具有能源和環(huán)保的雙重功效，已經成為環(huán)境生物技術領域的研究熱點之一。雖然，發(fā)酵法生物制氫技術有著廣闊的應用前景，但是該技術還處于研發(fā)階段。提高系統(tǒng)的產氫效率和運行穩(wěn)定性，降低生產成本，仍然是生物制氫技術實現(xiàn)工業(yè)化進程中面臨的根本問題。
　　利用活性污泥作為菌種發(fā)酵產氫時，反應系統(tǒng)中的微生物群落結構對產氫效能具有決定性的影響。因此，利用現(xiàn)代分子生物學手段闡明微生物群落結構與產氫效能的關系，確定重要的功能菌群，

2、建立產氫群落的快速分子檢測系統(tǒng)，實現(xiàn)高效產氫群落的定向構建和優(yōu)化，對實現(xiàn)發(fā)酵法生物制氫技術的工業(yè)化具有重要的理論意義和應用價值。目前，這些內容還沒有被系統(tǒng)性地研究。目前所報道的產氫細菌都因不具備凝集能力，而造成大量流失，降低了系統(tǒng)的產氫效能。而通過載體固定化技術必然大幅度增加運行成本。所以，分離具有高效產氫并能形成顆粒生長的自凝集細菌，通過生物強化作用實現(xiàn)高效產氫群落結構的構建，對實現(xiàn)發(fā)酵法生物制氫工業(yè)化更具有現(xiàn)實意義和重要的應用價值。

3、
　　針對目前發(fā)酵法生物制氫技術工業(yè)化進程中存在的問題，進行了自凝集產氫細菌的分離和篩選，并結合DGGE、FISH、克隆文庫、Real-time PCR、酶電泳等分子生物學手段，重點探討了微生物群落結構和產氫效能的關系，深入研究了乙醇型產氫發(fā)酵的形成機制，開發(fā)了產氫細菌的快速檢測方法，初步探討了生物強化技術定向優(yōu)化群落結構。論文取得了一些創(chuàng)新性的研究成果。
　?。?）發(fā)現(xiàn)并建立了產乙醇桿菌屬（Ethanoligenens）。

4、根據系統(tǒng)進化關系、獨特的化能異養(yǎng)特性、G+C（mol％）含量和生理生化特征，證實所分離的菌株 YUAN-3T和菌株 X-29代表了與最相近的柔嫩梭菌（Clostridium leptum）亞群現(xiàn)有屬完全不同的一個新屬。分類名為Ethanoligenens harbinense gen. nov., sp. nov.，哈爾濱產乙醇桿菌（Ethanoligenens harbinense）為模式種，菌株YUAN-3T（=JCM12961T=

5、CGMCC1.5033T）為模式菌株。菌株YUAN-3T振蕩培養(yǎng)時可形成凝集顆粒，直徑一般為0.5～5mm，最大時可達到1.5cm，培養(yǎng)液澄清；最大比產氫率為2.81molH2/mol-glucose，最大產氫速率為27.6mmolH2/g-drycell·h；是目前唯一報道的自凝集產氫細菌。
　?。?）揭示了不同產氫發(fā)酵類型微生物群落結構和演替規(guī)律。DGGE分析結果表明，反應器在運行7～14d時群落結構變化最大，群落結構的相似性

6、隨著運行時間的增加而逐漸升高。微生物群落結構的差異是導致產氫速率和發(fā)酵類型不同的直接原因。丙酸型、混合酸型和乙醇型群落結構主要是由Low G+C Gram-positive bacteria，Bacteroides，Actinobacteria，γ-Proteobacteria菌群構成，但是不同發(fā)酵類型優(yōu)勢種群的數量組成卻存在著很大的差異。乙醇型發(fā)酵產氫能力最高，為適宜的產氫發(fā)酵類型。
　?。?）揭示了乙醇型產氫發(fā)酵形成的生物機制

7、，證實了產氫-產乙醇細菌是乙醇型產氫發(fā)酵形成的直接原因。設計了發(fā)酵產氫細菌的Fe氫化酶基因（hydA）通用引物，證實能很好檢測群落中培養(yǎng)和未培養(yǎng)的產氫細菌。hydA與16S rRNA的DGGE分析和cDNA克隆文庫均表明反應器中的產氫細菌均是未培養(yǎng)的，與E. harbinense，Clostridium thermocellum，Syntrophobacter wolfei，Megasphaera elsdenii和Syntrophom

8、onas fumaroxidans親緣關系較相近，其中優(yōu)勢產氫細菌為E. harbinense和C. thermocellum相近的細菌。證實了利用乙醇脫氫酶（ADH）電泳技術可以分析群落中的未培養(yǎng)的產乙醇細菌。ADH酶譜顯示乙醇型產氫發(fā)酵的優(yōu)勢產乙醇細菌有三類，其中 ADH-I為非產氫種群， ADH-II和ADH-III分別為產氫細菌 E. harbinense和C. thermocellum相關的種群。據此，發(fā)現(xiàn)乙醇型產氫發(fā)酵群落中

9、的產氫-產乙醇細菌主要是E. harbinense及與E. harbinense和C. thermocellum親緣關系較近的未培養(yǎng)細菌。利用不同接種物，可以重現(xiàn)乙醇型發(fā)酵。
　?。?）利用自凝集產氫-產乙醇細菌實現(xiàn)了乙醇型產氫發(fā)酵的生物強化。分離了產乙醇桿菌的hydA基因，基于16S rRNA和hydA基因設計了產乙醇桿菌屬特異引物和探針，開發(fā)了其細胞數量和活性的特異檢測方法。實現(xiàn)了非滅菌條件下菌株 YUAN-3T的連續(xù)流產氫，