HPV16 E6-shRNA慢病毒的構(gòu)建及其對(duì)宮頸癌細(xì)胞抑制作用研究.pdf

1、人乳頭瘤病毒(humanpapillomavirusHPV)的感染是宮頸癌發(fā)生的必要條件，其中50％以上是HPV16型。HPV的E6和E7基因整合到宮頸上皮細(xì)胞并持續(xù)表達(dá)是引發(fā)宮頸癌的主要原因，同時(shí)也是維持宮頸癌惡性表型的必要條件。目前阻斷細(xì)胞內(nèi)整合型E6的表達(dá)主要使用反義核酸和靶向性核酶技術(shù)，但這兩種方法的抑制效率不高。因此尋找更有效阻斷的方法，對(duì)探索E6致癌及維持宮頸癌惡性表型的下游機(jī)制具有重要的意義。 由于傳統(tǒng)方法在晚期宮

2、頸癌的療效有限，近年來(lái)宮頸癌生物治療的研究顯示了很誘人的應(yīng)用前景。由于宮頸癌細(xì)胞中整合的HPV致癌基因與人體自身基因無(wú)同源性，因而成為理想的生物治療靶標(biāo)。 RNA干擾技術(shù)是通過(guò)雙鏈RNA來(lái)阻斷目的基因的表達(dá)，使用經(jīng)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄后形成的發(fā)夾狀短鏈干擾RNA(smallhairpinRNA，shRNA)，抑制靶基因的持續(xù)時(shí)間可達(dá)7天以上，同時(shí)很便于進(jìn)行實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體內(nèi)研究。慢病毒的感染效率高、激發(fā)免疫反應(yīng)的作用弱，是攜帶干擾RNA理想載

3、體。 目前以慢病毒為載體的shRNA抑制宮頸癌細(xì)胞中E6的表達(dá)尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，因此我們?cè)O(shè)計(jì)了三條靶向HPV16E6的shRNA表達(dá)序列，將其克隆到慢病毒工作質(zhì)粒PLL3.7中并經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定。PLL3.7與三種混合包裝質(zhì)粒以lipofectamine2000包裹后轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，由此產(chǎn)生shRNA重組慢病毒。以慢病毒感染宮頸癌Caski細(xì)胞后，檢測(cè)癌細(xì)胞中HPV16E6表達(dá)的變化，與E6致癌相關(guān)基因P21和P53表達(dá)的變化

4、；觀察細(xì)胞增殖能力和侵襲能力的變化。分別將shRNA處理的Caski細(xì)胞和對(duì)照Caski細(xì)胞種植于裸鼠皮下，觀察兩組細(xì)胞的成瘤能力。以Caski細(xì)胞種植于裸鼠皮下，待腫瘤形成后注射shRNA重組慢病毒，觀察移植瘤的生長(zhǎng)抑制情況；E6、P53和P21蛋白表達(dá)的變化。研究結(jié)果如下。 1.293FT細(xì)胞包裝出的慢病毒滴度為5×106TU/ml，濃縮后其滴度可達(dá)108TU/ml，其感染Caski細(xì)胞的最佳MIO為2.5。 2.慢

5、病毒感染后，Caski細(xì)胞中HPV16E6mRNA的含量下降80％，E6蛋白的表達(dá)下降75％；同時(shí)細(xì)胞中P53和P21蛋白表達(dá)水平明顯上升，約為對(duì)照組的2.5倍；shRNA作用一個(gè)月后，細(xì)胞中E6的表達(dá)水平仍為對(duì)照組的35％。 3.shRNA作用于Caski細(xì)胞7天后，細(xì)胞增殖能力下降，實(shí)驗(yàn)組僅為對(duì)照組細(xì)胞數(shù)的45％；細(xì)胞侵襲力下降，實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞比對(duì)照組減少65％。 4.shRNA作用后的Caski在裸鼠皮下未能長(zhǎng)出腫

6、瘤。 5.shRNA重組慢病毒注射后，裸鼠皮下腫瘤明顯縮小，其重量約為對(duì)照組的20％；腫瘤細(xì)胞中E6蛋白的表達(dá)下降，P53和P21蛋白的表達(dá)水平上升。 病毒感染增殖活躍的細(xì)胞，其最佳MIO多為1.0左右；由于受包裝系統(tǒng)效率的限制，一般逆轉(zhuǎn)錄病毒原液的滴度只有105TU/ml。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：慢病毒原液的滴度在106TU/ml以上；其感染宮頸癌Caski細(xì)胞的最佳MIO為2.5；無(wú)義慢病毒感染前后Caski細(xì)胞的形態(tài)和增殖能力

7、無(wú)明顯變化。這提示：增加慢病毒用量對(duì)宮頸癌Caski細(xì)胞無(wú)明顯毒性，卻能顯著提高靶細(xì)胞的感染率；慢病毒原液滴度高，濃縮后更可提升100倍以上，具有良好的實(shí)用性，是將目標(biāo)基因?qū)雽m頸癌細(xì)胞較理想的載體。 HPVE6蛋白結(jié)合P53并通過(guò)泛素途徑使其降解是細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵步驟之一。處于穩(wěn)定期的細(xì)胞DNA受到損傷時(shí)，P53數(shù)量的增加使細(xì)胞停止于G1期，使損傷的DNA在復(fù)制之前得以修復(fù)。P53能激活WAF基因，WAF基因產(chǎn)物P21可與C

8、dk家族的激酶結(jié)合并抑制其活性，使細(xì)胞周期停止。P53失活后對(duì)細(xì)胞增殖周期相關(guān)因子P21、PCNA、Cyclins、Cdks的調(diào)節(jié)作用喪失，細(xì)胞中DNA損傷積累造成細(xì)胞癌變。我們的研究表明：慢病毒感染Caski細(xì)胞后，能將shRNA表達(dá)序列整合到細(xì)胞基因組中，轉(zhuǎn)錄形成的shRNA能阻斷HPV16E6的表達(dá)，蛋白抑制率在65％以上；在HPV16E6表達(dá)下降后，其對(duì)P53的抑制作用被解除，細(xì)胞中P53蛋白的含量升高，P21蛋白的表達(dá)也升高。

9、這提示：我們構(gòu)建的shRNA重組慢病毒能高效地抑制癌細(xì)胞內(nèi)HPV16E6的表達(dá)，持續(xù)時(shí)間可達(dá)1月以上；這為深入研究E6致癌的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)提供了良好的工具。 HPVE6蛋白的持續(xù)表達(dá)是宮頸癌細(xì)胞維持惡性表型的關(guān)鍵因素之一。我們?cè)诩?xì)胞水平的研究表明，抑制E6蛋白的表達(dá)后細(xì)胞增殖能力和侵襲能力都大幅下降；進(jìn)一步通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，抑制E6蛋白的表達(dá)后，Caski細(xì)胞失去成瘤能力。在宮頸癌動(dòng)物模型體內(nèi)注射重組慢病毒后，shRNA被成功地帶

10、入癌細(xì)胞內(nèi)，E6蛋白的表達(dá)下降，P53和P21蛋白表達(dá)升高；同時(shí)腫瘤的體積縮小。這提示：慢病毒注射后，在體內(nèi)保持了很高的活性，對(duì)腫瘤細(xì)胞有良好的感染效率；攜帶shRNA的慢病毒在宮頸癌治療方面極具應(yīng)用前景。 綜上所述，本課題成功構(gòu)建了能高效抑制細(xì)胞中整合型E6表達(dá)的shRNA重組慢病毒，為進(jìn)一步研究E6致癌的下游機(jī)制提供了良好的工具。通過(guò)細(xì)胞水平研究證實(shí)了shRNA對(duì)宮頸癌細(xì)胞惡性表型的抑制作用；初步闡明了在動(dòng)物模型中以慢病毒攜