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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:
大鼠阿霉素腎病模型于20世紀(jì)80年代初期由國(guó)外文獻(xiàn)所報(bào)道,是目前公認(rèn)的能較好模擬人類腎臟疾病的動(dòng)物模型。大鼠阿霉素腎病具有慢性進(jìn)展性腎損害特點(diǎn),阿霉素通過破壞腎小球?yàn)V過屏障而引起蛋白尿。Podocin、Laminin(層粘蛋白,LN)、Fibronectin(纖連蛋白,F(xiàn)N)均參與腎小球?yàn)V過屏障的組成,對(duì)維持腎小球的正常濾過功能發(fā)揮著重要作用。Podocin、LN、FN在腎臟疾病發(fā)生發(fā)展過程中是如何變化的?它們與蛋
2、白尿的產(chǎn)生之間有無相互作用及作用機(jī)制尚不清楚。因此本課題從大鼠阿霉素腎病模型入手,通過動(dòng)態(tài)觀察Podocin、LN、FN在腎組織中的表達(dá)、分布情況及其與24小時(shí)尿蛋白的關(guān)系,探討其在蛋白尿發(fā)生發(fā)展過程中的作用機(jī)制及其相關(guān)性。
方法:
1、將30只雄性Sprague Dawley(SD)大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(6只)和阿霉素腎病模型組(24只)。阿霉素腎病模型組大鼠首次尾靜脈注射阿霉素(6.5mg/kg),七天
3、后再次經(jīng)尾靜脈注射阿霉素(4mg/kg)的方法建立模型。模型建立后隨機(jī)將阿霉素腎病模型組大鼠分為模型2周組、4周組、6周組、8周組,每組各6只。正常對(duì)照組大鼠于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)尾靜脈注射等劑量生理鹽水。
2、立春紅法觀察大鼠24小時(shí)尿蛋白定量(24hnp),全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血漿白蛋白(Alb)、血膽固醇(Cho1)、血肌酐(Scr)和血尿素氮(BUN)的變化,并比較模型各組與正常對(duì)照組間生化指標(biāo)的差別。
3、光鏡下
4、觀察各組大鼠腎組織的病理學(xué)變化,并比較模型各組與正常對(duì)照組間的差別。
4、用免疫組織化學(xué)二步法及冰凍切片免疫熒光法檢測(cè)各組大鼠腎組織中Podocin、LN和FN的表達(dá)及分布情況,并比較這三種蛋白在各模型組之間及與對(duì)照組間的表達(dá)情況及其與24小時(shí)尿蛋白定量的關(guān)系。
結(jié)果:
1、各組大鼠腎臟病理變化特點(diǎn)
光鏡下對(duì)照組大鼠腎小球毛細(xì)血管叢管腔開放程度好,未見腎小球節(jié)段硬化,腎小管上皮細(xì)胞
5、排列整齊。模型組大鼠隨著造模時(shí)間的增加,其腎小球系膜細(xì)胞數(shù)量依次增多,腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)顆粒及空泡變性,腎小管內(nèi)蛋白管型明顯增多。
2、各組生化指標(biāo)比較
模型2、4、6、8周組大鼠蛋白尿持續(xù)升高。其中模型6、8周組大鼠的24小時(shí)尿蛋白定量及血液生化指標(biāo)(血漿白蛋白、血膽固醇、血肌酐和血尿素氮)與對(duì)照組比較,差異有顯著意義(P<0.05)。模型組出現(xiàn)大量蛋白尿、低蛋白血癥、高脂血癥、腎功能減退,表現(xiàn)為典型的腎病
6、綜合征。
3、Podocin、LN、FN蛋白表達(dá)(免疫組化)情況
免疫組織化學(xué)二步法測(cè)定結(jié)果顯示,對(duì)照組podocin蛋白僅在腎小球基膜呈棕黃色顆粒強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá),podocin沿腎小球基膜呈均勻連續(xù)的線性分布。陰性對(duì)照腎組織無陽(yáng)性表達(dá)。模型2、4、6、8周組podocin蛋白的表達(dá)均明顯低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。對(duì)照組LN、FN蛋白在腎小球系膜區(qū)、基膜呈棕黃色顆粒少量表達(dá)。模型2、4、6、8
7、周組LN、FN蛋白的表達(dá)明顯高于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
4、Podocin、LN、FN蛋白免疫熒光定位
冰凍切片免疫熒光觀察結(jié)果顯示,對(duì)照組podocin蛋白主要分布在腎小球內(nèi),沿腎小球毛細(xì)血管袢呈均勻線性分布。模型2、4、6、8周組大鼠podocin蛋白隨病變進(jìn)展開始出現(xiàn)不連續(xù)分布。對(duì)照組LN蛋白主要分布于系膜基質(zhì)及基膜(包括腎小球、腎小囊、腎小管基膜);FN主要分布于系膜基質(zhì)。模型2
8、、4、6、8周組LN、FN蛋白的表達(dá)隨時(shí)間進(jìn)展表達(dá)皆增強(qiáng)。模型各組大鼠腎組織中podocin的表達(dá)均低于對(duì)照組(P<0.01),且隨著造模時(shí)間的加長(zhǎng)呈遞減趨勢(shì)。模型各組大鼠腎組織中LN和FN的表達(dá)均高于對(duì)照組(P<0.01),且隨著造模時(shí)間的加長(zhǎng)呈遞增趨勢(shì)。
5、Podocin、LN、FN蛋白與24小時(shí)尿蛋白水平的相關(guān)性
24小時(shí)尿蛋白定量與podocin蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
9、24小時(shí)尿蛋白定量與LN、FN蛋白的表達(dá)均呈正相關(guān),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
結(jié)論:
1、阿霉素所致的腎病綜合征模型隨著造模周期的延長(zhǎng)表現(xiàn)為大量蛋白尿,白蛋白逐漸降低,血肌酐、血尿素氮、血膽固醇逐漸升高,病變腎小球系膜細(xì)胞及基質(zhì)逐漸增多
2、Podocin表達(dá)異常與蛋白尿的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),可能是參與腎病病程進(jìn)展的重要因素。
3、層粘蛋白、纖連蛋白過表達(dá)很可能參與了病變腎
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