腫瘤壞死因子-α誘導的cIAP2蛋白抑制乙型肝炎病毒復制機理的研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)是困擾我國人民健康的重要傳染性病原體，據(jù)統(tǒng)計全球有3.5億左右的HBV感染者或者病毒攜帶者，中國有1.2億左右，這些HBV感染者有相當一部份發(fā)展成為慢性乙型肝炎，有些還可能進一步演變?yōu)楦斡不?、肝細胞癌等。國外有報道使用重組的腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor，TNF-α)可以非殺細胞的方式抑制HBV的復制，但是具體機制仍不清楚。目前一般認為，腫瘤壞死因子α

2、介導的抗病毒效應實質(zhì)是病毒和宿主細胞兩方面因素共同作用的結(jié)果，腫瘤壞死因子可以通過和受體的結(jié)合，引起一系列的信號的傳導過程，從而上調(diào)一些抗病毒蛋白的表達。 本室劉曉穎博士應用含有14112個靶基因的人cDNA微點陣，檢測了經(jīng)TNF-α處理6小時前后HeoG2細胞基因轉(zhuǎn)錄水平的變化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中8個基因發(fā)生上調(diào)，23個基因發(fā)生下調(diào)。應用Real Time-PCR驗證，證實cIAP2，B4-2,diubiquitin和MAD3等

3、基因的轉(zhuǎn)錄水平可受TNF-α調(diào)控，其中cIAP2蛋白能被顯著的上調(diào)。cIAP2蛋白是抑制凋亡蛋白(IAP)家族的一員，其C端為Ring結(jié)構，具有泛素連接酶3的活性；其N端為三個BIR模序，它們通過不同方式可以阻止多種內(nèi)、外源性信號所誘發(fā)的細胞凋亡，劉曉穎博士使用cIAP2蛋白表達質(zhì)粒與HBV復制型質(zhì)粒瞬時共轉(zhuǎn)染肝細胞，并檢測其對HBV基因復制和表達的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TNF-α在抑制HBV復制的同時，可以上調(diào)細胞內(nèi)源性cIAP2蛋白的表達；

4、cIAP2蛋白單獨表達即可抑制HBV蛋白的合成、基因的轉(zhuǎn)錄和復制。同時應用siRNA干擾cIAP2蛋白的內(nèi)源性表達后再用TNF-α進行處理，發(fā)現(xiàn)TNF-α對HBV RNA的抑制作用被減弱，提示cIAP2蛋白在TNF-α抑制HBV復制信號通路中發(fā)揮重要作用，但尚不明確其作用機制。 本研究首先重復劉曉穎博士siRNA的結(jié)果，ELISA．檢測證實針對cIAP2蛋白的siRNA可以減弱TNF-α抑制HBV復制的作用。進而構建或獲得cIA

5、P2蛋白的多種突變體，包括全長cIAP2(pRK5-Flag-clAP2)，cIAP2蛋白C端Ping結(jié)構部分缺失質(zhì)粒(pRK5-Flag-cIAP2△)，單獨表達cIAP2蛋白的N端質(zhì)粒(pRK5-Flag-cIAP2 N)以及單獨表達其C端的質(zhì)粒(pRK5-Flag-cIAP2 C)。將以上突變體和HBV復制型質(zhì)粒pHBV3.8(Adr)共同瞬時轉(zhuǎn)染Huh-7細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)cIAP2和cIAP2 C能夠降低細胞上清中HBsAg，HB

6、eAg的水平，同時能抑制細胞內(nèi)HBV的總RNA以及復制中間體HBV DNA的的水平，而cIAP2△和cIAP2N卻不表現(xiàn)出上述的變化，結(jié)果提示cIAP2蛋白抑制HBV的復制依賴于其C端的Ring結(jié)構的完整性。鑒于Northern Blot結(jié)果顯示cIAP2蛋白能夠抑制細胞內(nèi)HBV的總RNA水平，本研究檢測了cIAP2以及pRK5空載對于HBV四個啟動子報導質(zhì)粒SP1，SP2，EnI/Xp，EnII/Cp活性的影響。雙熒光報道系統(tǒng)檢測結(jié)果

7、發(fā)現(xiàn)，與空載相比，全長的cIAP2蛋白并不能顯著的影響HBV的啟動子的活性，表明cIAP2蛋白并不是通過影響HBV的啟動子的活性來發(fā)揮抑制：HBV復制的作用。有文獻報道轉(zhuǎn)錄因子NF-κB可以調(diào)節(jié)cIAP2蛋白的表達，而cIAP2蛋白又可通過正反饋的方式再次激活NF-κB。為了檢測cIAP2蛋白抑制HBV的復制是否通過激活NF-κB信號通路，將HBV復制型質(zhì)粒Adr，cIAP2單獨以及．Adr和cIAP2一起與NF-κB報道質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染H

8、uh-7細胞，同時加入重組的人TNF-α作為陽性對照。結(jié)果顯示，與對照組相比，單獨加入TNF-α或者在有HBV的情況下加入TNF-α，都可以顯著的上調(diào)NF-κB報道質(zhì)粒的活性，而cIAP2不能顯著地上調(diào)NF-κB報道質(zhì)粒的活性。以上結(jié)果表明cIAP2蛋白抑制HBV的復制并不是通過激活NF-κB信號通路來實現(xiàn)。 文獻報道cIAP2具有E3連接酶的活性，可以促進一些底物蛋白，譬如casp2Lse3等的降解。德國的一個研究小組報道，另

9、一種E3連接酶Nedd4可以促進HBV Core蛋白的泛素化。為了闡明cIAP2是否通過發(fā)揮E3連接酶的作用從而促進HBV關鍵蛋白的降解，進一步構建了HBV蛋白的表達質(zhì)粒，分別為pEGFP-HBV-Core，pEGFP-HBV-X，pcDNA3.1-3×Flag-HBV polymerase。將上述質(zhì)粒分別與全長的cIAP2質(zhì)粒和Ring結(jié)構部分缺失質(zhì)粒cIAP2△一起瞬時共轉(zhuǎn)Huh-7細胞，48小時后檢測上述蛋白的表達。Western

10、 Blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空載和突變體相比，全長的cIAP2蛋白并不能影響HBV-Core和HBV-X的表達，但是能夠抑制HBV多聚酶蛋白的表達。進一步的劑量依賴試驗證明cIAP2能夠以劑量依賴的方式抑制HBV多聚酶蛋白的表達，而cIAP2△則沒有表現(xiàn)上述特性。在上述實驗中加入蛋白酶體抑制劑MG132，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MG132能夠阻止cIAP2蛋白抑制HBV多聚酶蛋白表達的作用，提示cIAP2蛋白能夠促進蛋白酶體對于HBV多聚酶蛋白的降解。

11、 綜上所述，本研究部分揭示了TNF-α誘導的cIAP2蛋白抑制HBV復制的機制；證明cIAP2抑制HBV的作用依賴于其C端的Ring結(jié)構，并且發(fā)現(xiàn)cIAP2不能抑制HBV啟動子的活性，也不能通過激活NF-kb信號通路來發(fā)揮其抑制HBV復制的作用；cIAP2能夠促進HBV多聚酶蛋白的降解，并且這種促進作用可以被蛋白酶體抑制劑MG132所阻斷。本研究豐富了TNF-α抑制HBV作用機制的認識，并為研制新型抗HBV藥物提供了理論依據(jù)和實驗基礎