丙泊酚對內(nèi)毒素誘導(dǎo)A549細胞凋亡的影響及其機制初探.pdf

1、[目的]
　　本課題研究的目的是評估內(nèi)毒素對人肺腺癌細胞株(A549細胞)的細胞毒作用及其可能的分子機制，同時觀察丙泊酚對內(nèi)毒素誘導(dǎo)A549細胞凋亡的影響，旨在探討丙泊酚對內(nèi)毒素誘導(dǎo)的A549細胞凋亡保護作用，并初步從線粒體凋亡途徑揭示其保護作用的機理。為丙泊酚在膿毒癥致急性肺損傷的合理應(yīng)用提供實驗依據(jù)，為急性肺損傷的防治開拓新思路。
　　[方法]
　　不同濃度的內(nèi)毒素體外處理A549細胞，MTT法測量內(nèi)毒素在體外對A

2、549細胞活性影響的量效和時效關(guān)系，確定合適的染毒劑量;丙泊酚處理后測量線粒體膜電位(JC-1作為熒光探針)、ATP酶活性(ATP酶活性檢測試劑盒)、caspase9酶活性的變化(caspase9酶活性檢測試劑盒);活性氧檢測試劑盒檢測細胞ROS水平;流式細胞儀檢測A549細胞凋亡率的變化及Ca2+水平;RT-PCR檢測線粒體順烏頭酸酶(ACO2) mRNA的表達，用Western-blot技術(shù)檢測ACO2蛋白的表達，分析丙泊酚對內(nèi)毒素

3、誘導(dǎo)的細胞凋亡率的變化及對線粒體功能的影響。
　　[結(jié)果]
　　1.在內(nèi)毒素作用0～50μg/ml濃度范圍作用下，A549細胞的生長活性隨著內(nèi)毒素濃度的增高而降低，與內(nèi)毒素的濃度呈負相關(guān)（趨勢x2檢驗，P＜0.05），IC50為10μg/ml。故選用10μg/ml的內(nèi)毒素作用不同時間，0～24h范圍內(nèi)，隨著處理時間的增加，A549細胞的活性降低，與內(nèi)毒素作用時間呈負相關(guān)(趨勢x2檢驗，P＜0.05)。
　　2.10μg

4、/ml內(nèi)毒素刺激A549細胞時用不同濃度的丙泊酚(25uM、50uM、100uM)分別處理，激光共聚焦顯微鏡下JC-1探針觀察到A549細胞的紅色熒光/綠色熒光強度逐漸增強（q檢驗，各組間P＜0.05）。酶標儀檢測Caspase-9酶活性逐漸減弱（q檢驗，各組間P＜0.05）而ATP酶活性逐漸增強(q檢驗，各組間P＜0.05)。
　　3.DCFH-DA探針經(jīng)流式細胞儀檢測丙泊酚抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的ROS生成（P＜0.05）;Fluo-

5、3AM探針測得丙泊酚抑制Ca2+水平增高(P＜0.05);用Annexin-V/FITC探針經(jīng)流式細胞儀檢測丙泊酚劑量依賴性地抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的細胞凋亡(P＜0.05)，TUNEL法顯示丙泊酚還能抑制DNA斷片形成，阻止晚期凋亡的發(fā)生(P＜0.05)。
　　4.內(nèi)毒素刺激下丙泊酚能夠促進線粒體ACO2的mRNA及蛋白質(zhì)的表達（x2檢驗，P＜0.01）。
　　[結(jié)論]
　　內(nèi)毒素可使肺泡上皮細胞生長活性降低，且該效應(yīng)具有劑