皂角刺總黃酮的提取、純化及抗腫瘤活性研究.pdf

1、目的:以有機(jī)溶劑乙醇回流提取中藥皂角刺中的總黃酮成分,并上聚酰胺柱進(jìn)行純化,得到兩批含量不同的總黃酮樣品。以CCK-8法測定皂角刺總黃酮粗提物及純化后對體外四種腫瘤細(xì)胞增殖作用的影響,旨在為課題后期皂角刺總黃酮的進(jìn)一步分離及制備單體的研究提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:在前期實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上,以最佳的提取工藝條件回流提取皂角刺中的黃酮類組分,然后對皂角刺總黃酮粗提物的純化進(jìn)行研究,得出最佳精制條件。根據(jù)顏色反應(yīng)及紫外光譜定性產(chǎn)

2、品中黃酮類化合物具有黃酮的吸收光譜特征,可以確定產(chǎn)品可能屬黃酮類。對粗提取物和純化后的皂角刺總黃酮進(jìn)行紫外-可見分光光度法含量測定。最后分別選用K562人白血病細(xì)胞株,Bel-7402人肝癌細(xì)胞株,SMMC-7721人肝癌細(xì)胞株,HCT116人結(jié)腸癌細(xì)胞株,體外培養(yǎng)于含10％胎牛血清的RPM11640培養(yǎng)基,置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中。取對數(shù)生長期的細(xì)胞,調(diào)整合適的細(xì)胞懸液密度,分別接種于96孔培養(yǎng)板,用不同濃度(250、125、6

3、2.5、31.25、15.625)μg·mL-1的皂角刺總黃酮粗提物及純化后分別處理48小時后,以CCK-8法測定皂角刺總黃酮粗提物及純化后對體外腫瘤細(xì)胞增殖作用的影響,并對2組間數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn),分析兩者是否存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:聚酰胺純化的最佳條件為:上樣濃度1mg·mL-1,上樣體積1.5BV,40％的乙醇4.5BV(床體積)洗脫,洗脫流速3BV／h。采用加熱回流提取-聚酰胺純化的工藝路線,此條件下得到的洗脫液通過真

4、空減壓干燥,得到黃褐色的總黃酮粉末。紫外-可見分光光度法(比色法)含量測定達(dá)到58.84％,經(jīng)聚酰胺二次吸附、洗脫后,粗制皂角刺總黃酮產(chǎn)品的純度提高到81.84％,達(dá)到較好的純化效果。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品,建立了標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=1.1939x-0.0068,r=0.9999,線性關(guān)系在0.053—0.848mg范圍內(nèi)?？傸S酮平均回收率為96.7％,RSD為2.02％(n=6)。皂角刺總黃酮對各腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用隨著濃度的增加而增強(qiáng)

5、,呈現(xiàn)出較好的量效關(guān)系。皂角刺總黃酮純化后(含量81.84％)對K562、HCT116、SMMC-7721、Bel-7402的IC50分別為(30.30±14.30)、(75.30±4.96)、(19.36±1.78)、(42.45±17.57)μg·mL-1。皂角刺總黃酮粗提物(含量58.84％)對K562、HCT116、SMMC-7721、Bel-7402的IC50分別為(106.04±35.59)、(106.85±35.77)、(

6、120.68±16.22)、(68.89±2.30)μg·mL-1,P<0.05,皂角刺總黃酮粗提物及純化后的抗腫瘤活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論:采用加熱回流提取-聚酰胺純化的工藝路線,能夠使粗制皂角刺總黃酮產(chǎn)品的純度從58.84％提高到81.84％,利用紫外-可見分光光度法(比色法)測定皂角刺總黃酮含量,方法簡單,且穩(wěn)定性、精密度均良好。皂角刺總黃酮純化后的抗腫瘤活性優(yōu)于粗提物,并且呈現(xiàn)出一定的濃度依賴性,具有較強(qiáng)的體外