IRAK-4在內毒素誘導的再灌注期移植肝臟枯否細胞激活中的調控作用.pdf

1、目的：缺血再灌注損害(ischemia／reperfusioninjury，I／RI)是導致移植肝功能不良或無功能、進而造成移植失敗，機體死亡的重要原因之一，目前仍無有效的治療對策。全身80％一90％的單核一巨噬細胞為滯留于肝血竇內的kupffer細胞(kupffercells，KCs)。實際上，KCs過度激活導致促炎癥細胞因子腫瘤壞死因子一Q(tumornecrosisfactor，TNF-~)釋放是引發(fā)肝臟工／RI的關鍵因素。已證實

2、內毒素是造成肝移植再灌注期KCs過度激活的重要原因之一。內毒素是革蘭氏陰性桿菌生長時釋放或死亡時裂解出來的細胞壁脂多糖(1ipopolysacharide，LPS)成分，主要通過與單核一巨噬細胞相結合而誘導相應的生物效應。實驗證明，大鼠經小劑量內毒素預處理誘導內毒素耐受(endotoxintolerance，ET)后，能對隨之發(fā)生的I／R工產生交叉耐受(cross-toleration)作用，此時TNF—Q含量明顯下降，工／R工程度顯著

3、減輕，但其相關機制并未完全闡明。最新研究表明，白細胞介素一1受體相關激酶一4(interleukin一1receptorassociatedkinase-4，IRAK-4)是位于NF-KB上游的調節(jié)內毒素信號轉導的最關鍵因子[3]。工RAK-4不僅可能是LPS信號轉導的最關鍵調控分子，其活性變化還可能是誘導ET形成的最關鍵因素，因此也應該是最理想的治療靶點。 目前，臨床上對I／R工的防治并無有效的手段；而內毒素臨床應用的安全性尚

4、有待評估，同時在術前數天給于內毒素預處理供體以期誘導盯也并不現實，因此如能證實IRAK一4活性改變也是內毒素預處理誘導的對I／RI交叉耐受的關鍵步驟，將有可能為防治肝移植I／R工的基因治療提供理想的治療靶點。然而，作為2002年才被發(fā)現的IRAK家族最新成員，還有許多問題尚待解決：①誘導ET后，最終能抑制工RAK一4活性，但目前并未分離出明確的活性調控蛋白。IRAKs家族活性的變化可能是田形成的最關鍵因素，是由于其他信號轉遞因子均不是誘

5、導ET形成的必需條件。由于認知的局限性，并不能排外關鍵性調控因子尚未被發(fā)現的可能，因此IRAK一4活性的變化是否是ET形成的最關鍵因素仍有待進一步證實。②現有的研究均以腹腔或血液巨噬細胞，甚至腫瘤性巨噬細胞株等為研究對象，尚無研究工RAK-4在KCs內毒素信號轉導中的調控效應；也未涉及因為肝移植(其血液LPS濃度明顯低于實驗用LPS濃度，但KCs對LPS高度敏感)的特殊情況下IRAK一4的調控作用。更無抑制IRAK一4表達后，對I／R工

6、是否具有交叉耐受效應的研究。③另外，IRAK-4基因敲除動物或IRAK-4基因突變的患者，因對LPS永久性無應答會導致反復嚴重的細菌感染。I／RI只是肝移植早期的一個病理生理過程，那能否短暫封閉特定靶器官的IRAK一4基因，而不會長期干擾機體對細菌的清除? 因此，在本實驗中我們將觀察：①以內毒素耐受(ET)為基礎誘導的大鼠移植肝臟對缺血再灌注損害(工／RI)交叉耐受的過程中，白細胞介素一1受體相關激酶一4(工RAK-4)及相關內

7、毒素信號轉導分子表達的變化，分析內毒素在移植肝臟工／RI中的作用及誘導盯建立交叉耐受與IRAK一4表達改變的關系。②利用siRNA技術的轉錄后沉默特性，探討以工RAK一4特異性短發(fā)夾RNA(shRNA)對內毒素誘導的枯否細胞(KCs)激活效應的可行性。③通過觀察活體或冷保存期離體門靜脈灌注大鼠供肝，轉染IRAK-4shRNA對再灌注后受體肝臟工／R工及內毒素效應相關因子表達的影響，判斷以IRAK-4為肝移植I／RI治療靶點的可行性并探索

8、可行的shRNA治療途徑。如果能證實IRAK-4在LPS誘導的KCs激活中的作用，在基因治療日益向臨床過渡的今天，將為肝移植工／R工的基因治療或藥物開發(fā)提供新的靶點，具有較大的理論意義和臨床應用前景。 方法①雄性SD大鼠，隨機分為正常對照組、缺血再灌注組(I／R組)和內毒素耐受組(ET組)。以未經任何處理的大鼠肝臟為正常對照；盯組供體第M經尾靜脈給予脂多糖(LPS)0．1mg．kg-'，第2d、3d、4d、5d給予0．5mg．k

9、g-1；I／R組供體給予等體積0．5ml無菌PBS液。第8d，切取供體，以未經任何處理的大鼠為受體，兩袖套法建立大鼠原位肝移植模型。按門靜脈血流恢復后第Omin、60min及180min分為三個亞組。光鏡及電鏡檢查肝臟組織的病理改變情況；免疫組織化學及逆轉錄一聚合酶鏈式反應(RT-PCR)測定肝組織的IRAK一4mRNA和蛋白表達水平；酶連免疫吸附法(ELISA)肝組織核因子一KB(NF-KB)活性及血清腫瘤壞死因子一Q(TNF—Q)含

10、量。②構建2對表達IRAK-4-shRNA的陽性載體質粒(pSIIRAK-4-A，pS工IRAK-4-B)及l(fā)對陰性載體質粒(pS工IRAK一4-C)。分離培養(yǎng)Balb／C小鼠KCs，分為正常對照組，RNAi對照組(轉染pSIIRAK一4-C)與RNAi抑制組(轉染pS工IRAK-4一A，pSI工RAK一4-B)。質粒轉染后24h，加入0．1μg·ml-1LPS。6h后，蛋白免疫印記法(Western-blot)及24一PCR測定IRA

11、K-4蛋白和mRNA表達水平；ELISA檢測0h，1h，3h，6h，12h后KCs的核因子一KB(NF一KB)活性及培養(yǎng)上清液TNF-Q含量。③雄性SD大鼠，隨機分為冷缺血轉染組、活體轉染組、對照組，以兩袖套法建立同種異體肝移植模型。冷缺血轉染組于冷缺血期經門靜脈灌注轉染攜帶IRAK-4-shRNA的轉染質粒pS工IRAK-4-A；活體轉染組在門靜脈袖套吻合完成后，經門靜脈分支注入pSIIRAK-4-A；對照組不予任何處理。按門靜脈血流

12、恢復后第Omin、60min及180min分為三個亞組，光鏡及透射電鏡檢查肝臟組織的病理形態(tài)學改變情況；免疫組織化學，Western-b10t及RT-PCR測定肝組織工RAK-4蛋白和mRNA表達；ELISA法檢測肝組織NF一KB活性及血清TNF—Q含量。 結果①再灌注后Omin、60min及180min，I／R組與ET組的IRAK一4蛋白與mRNA表達水平，NF-KB活性以及TNF-Q含量均高于正常對照組(P<0．01)；再灌

13、注后Omin，工／R組與盯組的NF-KB活性以及TNF-Q含量差別無顯著性(P>0．05)，但IRAK-4蛋白與mRNA表達水平高于ET組(P<0．01)；再灌注60min及180min，I／R組的上述各指標均明顯高于后者(P<0．01)。再灌注后180min，ET組僅見輕度肝細胞、竇內皮細胞腫脹和炎癥細胞浸潤；I／R組的肝細胞、血竇內皮中度腫脹，血竇擴張，內有較多KCs和中性粒細胞浸潤，部分血竇內皮消失，直接完全暴露的肝細胞個別見壞死

14、，內質網擴張明顯。②RNAi抑制組IRAK一4表達水平，以及LPS刺激后1h，3h及6h的NF-KB活性、TNF-Q含量均明顯低于正常對照組和RNAi對照組(P<0．01)；尤其是pSI工RAK-4一A組，LPS刺激前后上述各指標差異無顯著性(P>0．05)，抑制效果明顯優(yōu)于pS工工RAK一4一B(P<0．0D。③再灌注后活體轉染組、對照組的工RAK-4蛋白與mRNA表達水平、NF-KB活性以及TNF-Q含量均高于冷缺血轉染組(P<0．

15、01)；冷缺血轉染組的IRAK-4表達明顯抑制，再灌注后各時點差異無顯著性(P>0．05)。再灌注后180min，冷缺血轉染組超微結構改變與內毒素預處理后相似，僅見輕度肝細胞、竇內皮細胞腫脹和炎癥細胞浸潤；而活體轉染組表現出明顯的肝臟病理改變：其肝細胞明顯氣球樣變、線粒體、血竇內皮中度一重度腫脹，內質網及血竇明顯擴張，內有較多KCs和中性粒細胞浸潤；部分血竇內皮消失，暴露的肝細胞直接與KCs接觸，甚至可見個別肝細胞壞死。 結論①