PK--15細(xì)胞α干擾素效應(yīng)因子檢測(cè)方法建立及在JAK--STAT信號(hào)通路機(jī)制探討中的應(yīng)用.pdf

1、Theestablishmentandpreliminary001icationofrealtimefl『1；centaOOlicationarealtiefluorescentquantitativePCRassayfordetectingQ—interferoneffectfactorofPK一15cellsThesissubmittedtogngDaoAgriculturalUniversityInFulfillmentofthe

2、RequirementfortheDegreeofMasterofAgronomyZouRongkai(DepartmentofAnimalScienceandVeterinaryMedicine)Supervisor：ProfessorWangJinbaoQingdaoChinaPK一15細(xì)胞Q干擾素效應(yīng)因子檢測(cè)方法建立及在JAKSTAT信號(hào)通路機(jī)制探討中的應(yīng)用摘要豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)在病毒學(xué)分類上屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬。PC

3、V2是一種無囊膜、單股環(huán)狀DNA病毒，能夠引起斷奶豬多系統(tǒng)衰竭綜合征等多種疾病，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。許多病毒及其蛋白能夠調(diào)控感染細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)信號(hào)途徑，還可以影響aIFN信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，這可能是病毒感染和對(duì)et[FN無應(yīng)答的重要機(jī)制之一，但是PCV2通過JAKSTAT信號(hào)通路抑制機(jī)體旺IFN產(chǎn)生的機(jī)制未見深入研究，因此研究PCV2通過JAKSTAT信號(hào)通路抑制機(jī)體0【IFN產(chǎn)生的機(jī)制顯得尤為重要。本研究的第一部分根據(jù)GenBank中豬的

4、Mxl、OAS和13actin等基因的基因序列，利用分子生物學(xué)軟件Premier50在其保守區(qū)設(shè)計(jì)并合成了相應(yīng)的特異性引物。利用TRIzol法提取PK15細(xì)胞總RNA，經(jīng)Oligod(T)15進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，利用合成的引物PCR擴(kuò)增各段目的基因，并克隆至pMDt8T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，以鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品模板建立SYBRGreenI熒光定量RTPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶解曲線，并進(jìn)行敏感性、特異性和重復(fù)性試驗(yàn)。對(duì)建立的PK15細(xì)

5、胞I型干擾素(0【IFN)效應(yīng)因子SYBRGreenI實(shí)時(shí)熒光定量RTPCR方法進(jìn)行分析，結(jié)果表明，所建立的aIFN效應(yīng)因子SYBRGreenI熒光定量RTPCR檢測(cè)方法靈敏度高、特異性強(qiáng)，重復(fù)性好，且該方法測(cè)得的目的基因、Mxl、OAS和內(nèi)參[3actin標(biāo)準(zhǔn)品基因的cp值與標(biāo)準(zhǔn)品稀釋度在l1011108copies／uL的范圍內(nèi)分別呈良好的線性關(guān)系，可以用于檢測(cè)PCV2蛋白對(duì)I型干擾(o【IFN)素效應(yīng)因子影響的試驗(yàn)中。本研究的第二

6、部分中，在生長(zhǎng)狀態(tài)良好的單層PK15細(xì)胞上接種PCV2，在此基礎(chǔ)上摸索出干擾素的適合添加濃度為750U／mL和最佳作用時(shí)間為12小時(shí)，在以未做任何處理的PK15細(xì)胞和僅被GtIFN處理的PK15細(xì)胞作為對(duì)照的情況下，研究了PK15細(xì)胞在接種PCV2，并受到(1IFN刺激后Mxl、OAS的相對(duì)表達(dá)量變化情況。結(jié)果表明，PK15細(xì)胞在接種PCV2，并受到a—IFN刺激后Mxl、OAS的相對(duì)表達(dá)量較僅被ctIFN處理的PK15細(xì)胞明顯降低，但