酒精對(duì)大鼠胰島素敏感性的影響及相關(guān)機(jī)制的研究.pdf

1、2型糖尿病人數(shù)在全球范圍內(nèi)不斷快速地增長(zhǎng)，這使其成為21世紀(jì)危害人體健康的主要疾病之一。胰島素抵抗是2型糖尿病的發(fā)病基礎(chǔ)，其發(fā)生與生活方式有很大的關(guān)系，如吸煙、肥胖、運(yùn)動(dòng)、妊娠等等。近年來(lái)，流行病學(xué)的調(diào)查結(jié)果顯示：酒精與胰島素抵抗和2型糖尿病發(fā)病之間存在著U或J型的相關(guān)關(guān)系。長(zhǎng)期規(guī)律性適量飲酒升高胰島素的敏感性而降低患糖尿病的危險(xiǎn)性，而長(zhǎng)期過(guò)量飲酒卻降低胰島素的敏感性而增加患糖尿病尤其是患2型糖尿病的危險(xiǎn)性。有關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果也表明，酒

2、精可以造成外周組織對(duì)葡萄糖的利用障礙和胰島素抵抗。但是目前相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究還很少，有關(guān)研究結(jié)論存在明顯的分歧，酒精引起外周組織胰島素抵抗的分子機(jī)制尚不清楚。我國(guó)是酒的生產(chǎn)、消費(fèi)大國(guó)，有著豐富的酒文化。對(duì)酒精致胰島素抵抗相關(guān)機(jī)制的研究將有助于糖尿病的預(yù)防以及為調(diào)整飲酒習(xí)慣提供科學(xué)依據(jù)。胰島素抵抗發(fā)生的機(jī)制十分復(fù)雜，與胰島素信號(hào)能否正常傳導(dǎo)有關(guān)。胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中關(guān)鍵分子的數(shù)量和/或功能異常將導(dǎo)致機(jī)體對(duì)葡萄糖的利用降低。而胰島素介導(dǎo)的葡萄糖

3、攝取，80％以上由骨骼肌細(xì)胞負(fù)責(zé)。骨骼肌是胰島素的重要靶器官之一，也是機(jī)體攝取血糖、調(diào)節(jié)血糖水平和參與能量代謝的主要器官之一，在胰島素抵抗的發(fā)病中起重要作用。
　　 因此，本研究擬從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和體外原代培養(yǎng)骨骼肌細(xì)胞兩個(gè)方面，研究酒精對(duì)胰島素敏感性及骨骼肌中胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中關(guān)鍵分子表達(dá)或活性的影響，以期揭示酒精致胰島素抵抗的分子機(jī)制。本研究主要包括二部分，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下：
　　 第一部分
　　 目的：建立了長(zhǎng)

4、期飲酒的動(dòng)物模型，研究不同濃度酒精對(duì)大鼠機(jī)體胰島素敏感性的影響；選擇骨骼肌組織為靶組織，研究酒精對(duì)其胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中關(guān)鍵分子的影響，以確定酒精的作用位點(diǎn)和探討相關(guān)作用機(jī)制。
　　 方法：清潔級(jí)Wistar大鼠80只(雌雄各半)，按體重隨機(jī)分為對(duì)照組和低、中、高劑量組，酒精劑量分別為0、0.8、1.6、2.6 g?(kg?bw)-1?day-1，每日一次通過(guò)灌胃方式給予。19周末，處死大鼠，收集血液，分離血清，測(cè)定空腹血糖和血

5、胰島素，并在此基礎(chǔ)上計(jì)算HOMA(Homeostasis Model Assessment)胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR＝[FPG(mmol/L)×FIN(mIU/L)]/22.5)和HOMA-βcell(HOMA-βcell =20×FINS/(FPG-3.5)作為反映胰島素敏感性、胰島β細(xì)胞功能的指標(biāo)。分離骨骼肌，通過(guò)RT-PCR和Western blot方法測(cè)定胰島素受體(insulin receptor，IR)、胰島素受體底物

6、-1(insulin receptor substrate-1,IRS-1)、胰島素受體底物-2(insulin receptor substrate-2,IRS-2)、磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI-3K)調(diào)節(jié)亞基p85α、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4(glucosetransporter 4，GLUT-4)mRNA或蛋白表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：1.雄性大鼠：低、中劑量組空腹胰島素水平升高

7、(p＜0.05)，而血糖升高不明顯(p＞0.05)。高劑量組空腹血糖水平升高(p＜0.05)，胰島素水平輕微降低。各酒精組Ln(HOMA-IR)均較對(duì)照組升高(p＜0.05)，提示大鼠了發(fā)生胰島素抵抗。各實(shí)驗(yàn)組之間HOMA-βcell無(wú)明顯差異；雌性大鼠：隨著酒精劑量的增加，大鼠空腹血糖水平逐漸升高而胰島素水平則逐漸降低，高劑量組空腹血糖的升高和胰島素分泌的減少與對(duì)照組比較有顯著性(p＜0.05)。HOMA-βcell在中、高劑量組降低

8、(p＜0.05)，提示大鼠胰島β細(xì)胞分泌功能降低。Ln(HOMA-IR)在各實(shí)驗(yàn)組之間無(wú)明顯差異(p＞0.05)。
　　 2.中、高劑量組雌、雄大鼠骨骼肌組織IR、IRS-1mRNA表達(dá)下降(p＜0.05)。低劑量組IRS-1mRNA表達(dá)在雄性大鼠中升高(p＜0.05)，雌性大鼠中無(wú)明顯變化。隨著酒精劑量的增加，雌、雄大鼠骨骼肌IRS-2mRNA表達(dá)均出現(xiàn)降低的趨勢(shì)，但與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(p＞0.05)。
　　 3

9、.雌、雄大鼠PI-3K(p85α)、GLUT-4mRNA和蛋白表達(dá)在中、高劑量組降低(p＜0.05)。低劑量組雄性大鼠 PI-3K(p85α)mRNA和蛋白表達(dá)升高(p＜0.05)，在雌性大鼠中PI-3K(p85α)表達(dá)降低，但與對(duì)照組比較差異無(wú)顯著性(p＞0.05)。
　　 結(jié)論：酒精劑量＞＝0.8g?(kg?bw)-1?day-1時(shí)，長(zhǎng)期酒精攝入降低大鼠胰島素敏感性。酒精對(duì)胰島素敏感性的影響存在著性別差異，雌性動(dòng)物比雄性動(dòng)物

10、更敏感；大鼠骨骼肌組織中IR、IRS-1，PI-3K(p85α)、GLUT-4mRNA和(或)蛋白表達(dá)水平的降低可能是酒精影響胰島素敏感性的分子機(jī)制之一。酒精對(duì)骨骼肌組織胰島素信號(hào)通路具有多位點(diǎn)的影響作用。
　　 第二部分
　　 目的：以原代培養(yǎng)的大鼠骨骼肌細(xì)胞為對(duì)象，研究酒精直接作用對(duì)骨骼肌細(xì)胞葡萄糖攝取能力及相關(guān)信號(hào)分子表達(dá)和活性的影響，從而進(jìn)一步探討和驗(yàn)證酒精與胰島素抵抗的關(guān)系和相關(guān)機(jī)制。
　　 方法：體外

11、原代培養(yǎng)大鼠骨骼肌細(xì)胞，用不同濃度酒精(0、25、50、100、200、400mmol/L)作用24小時(shí)及200mmol/L酒精作用不同時(shí)間(6、12、24h)，通過(guò)3H-2-脫氧葡萄糖攝取實(shí)驗(yàn)檢測(cè)酒精對(duì)大鼠骨骼肌細(xì)胞胰島素敏感性的影響。通過(guò)RT-PCR和Western blot方法測(cè)定PI-3K(p85α)、Akt-2、 GLUT-4 mRNA或蛋白表達(dá)水平，同時(shí)測(cè)定胰島素刺激下PI-3K，AKT磷酸化的水平。
　　 結(jié)果：1

12、.200、400mmol/L酒精作用24小時(shí)抑制骨骼肌細(xì)胞基礎(chǔ)狀態(tài)和胰島素刺激的葡萄糖攝取(p＜0.05)。50、100mmol/L酒精作用24小時(shí)，在基礎(chǔ)狀態(tài)下沒(méi)有明顯影響作用，但是可以提高胰島素刺激下骨骼肌細(xì)胞攝取葡萄糖的能力(p＜0.05)。骨骼肌細(xì)胞在200mmol/L作用下，隨著作用時(shí)間的變化表現(xiàn)出6小時(shí)提高胰島素刺激下的葡萄糖攝取(p＜0.05)，而作用24小時(shí)具有抑制作用(p＜0.05)。
　　 2.作用24小時(shí)：

13、400mmol/L酒精降低PI-3K(p85α)mRNA和蛋白表達(dá)(p＜0.05)。200、400mmol/L酒精抑制Akt-2蛋白和GLUT-4mRNA和蛋白表達(dá)(p＜0.05)，而100mmol/L酒精組Akt-2蛋白表達(dá)水平升高(p＜0.05)，50、100mmol/L酒精作用GLUT-4mRNA和蛋白表達(dá)均升高(p＜0.05)。胰島素刺激下，50、100mmol/L 酒精組PI-3K及Akt的磷酸化水平升高明顯，而200、400

14、mmol/L酒精作用對(duì)PI-3K及Akt的磷酸化具有抑制作用(p＜0.05)；200mmol/L酒精作用6小時(shí)，Akt-2蛋白和GLUT-4mRNA和蛋白表達(dá)升高(p＜0.05)，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，上述信號(hào)分子的表達(dá)逐漸降低。
　　 結(jié)論：酒精的直接作用可以影響大鼠骨骼肌細(xì)胞的胰島素敏感性，與酒精作用劑量和時(shí)間有關(guān)。長(zhǎng)期高劑量酒精作用(200、400mmol/L酒精作用24小時(shí))造成骨骼肌細(xì)胞胰島素抵抗；酒精的直接作用可以影響