MiR-221在前列腺癌雄激素非依賴轉變過程中作用的研究.pdf

1、前列腺癌(Prostate cancer，PCa)在許多西方國家是男性最常見的惡性腫瘤之一，占男性癌癥死因的第二位。在我國，近年來隨著生活水平的提高及人均壽命的延長，前列腺癌發(fā)病率也呈現(xiàn)明顯上升趨勢。自1941年Huggins等采用雄激素剝奪療法治療晚期前列腺癌取得顯著療效后，激素治療逐漸成為治療前列腺癌的一項重要的方法。這種方法早期一般是有效的，此時稱激素敏感型前列腺癌(androgen-dependent ostate cancer

2、，ADPC)，其有效率一般可達70％左右，然而，經(jīng)過12～16個月病情緩解期后，幾乎無一例外的會進展為激素非敏感的前列腺癌(androgen-independent prostate cancer，AIPC)，此期患者病情不可遏制的急劇惡化，腫瘤迅速轉移侵襲其它器官，最終因此導致患者死亡。治療失敗的原因是缺乏對于激素非依賴型前列腺癌的有效治療方法，此外，也因為缺乏簡便準確的早期前列腺腫瘤分期判定手段，醫(yī)生只有在多次穿刺，結合ADT治療行

3、進過程中PSA觀察，定奪治療方案，這樣不僅增加了患者痛苦，也容易導致患者錯過最佳治療時期。因此，探索敏感、特異、準確的前列腺癌分子標志物，實現(xiàn)腫瘤的早期珍斷，以及尋找遏制前列腺癌進入激素非依賴期的藥物，成為泌尿外科研究迫切需要解決的問題。
　　 以往利用基因芯片和蛋白組學等方法，科研工作者對AIPC機制已經(jīng)開展大量研究，極大推動了對AIPC機制的了解。例如發(fā)現(xiàn)對前列腺癌具有代表性的分子除了PSA，還包括OC，PSMA，PAP，P

4、SMA，這些分子都是治療前列腺癌治療潛在的靶標，但是深入研究表明，雖然這些分子聯(lián)合PSA檢測，提高了PCa的分期診斷，特異性和敏感性卻始終不能突破PSA對Pca的意義，對于AIPC的珍治始終缺乏有力的突破。
　　 近年來microRNA(miRNA)在腫瘤發(fā)生發(fā)展及耐藥性中發(fā)揮重要調(diào)控作用相應得以證實，部分miRNA在相應腫瘤中作用甚至申請國際專利保護，其對腫瘤的重要性迅速引起研究者興趣。通過計算機分析，人類約30％的編碼蛋白基

5、因被miRNA所調(diào)控，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的人類miRNA大部分(52％)都位于已知的腫瘤相關基因組區(qū)域內(nèi)或已知的基因脆性位點，改變特異性miRNA的表達導致象腫瘤樣疾病的觸發(fā)和進展。逐漸明確的miRNA表達譜研究使其迅速成為新的臨床輔助手段：1、miRNA表達譜為診斷工具。不明原發(fā)部位的轉移性癌是癌癥診斷中常見的一種情況。2、miRNA表達譜做為預后工具。值得關注是，miRNA表達的變化，尤其對低分化的腫瘤具有重要指導意義，而前列腺癌正屬于低分化

6、腫瘤的范疇，提示miRNA檢測可能為前列腺癌AIPC研究提供了新的突破口。這引起了眾多前列腺癌科研工作者的關注，miRNA針對PCa表達譜以及前列腺良性增生的表達譜近年累計有更新報道，雖然如此，針對PIN發(fā)展成癌變以及針對ASPC進展為AIPC其中具有重要調(diào)控作用的miRNA，實驗性研究才剛剛起步。
　　 本研究獲得AIPC5例標本，和ADPC5例標本一同送往通過國際認證的miRNA芯片公司，在原位組織篩選獲得珍貴的miRNA差

7、異信息。并后期Nothern驗證，確證miRNA-221表達差異顯著。而我們的結果提示，miR-221可能在晚期前列腺癌的雄激素治療非依賴化進程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，其具體作用機制和表達量可能跟前列腺癌細胞命運甚至疾病進程密切相關，為了進一步明確miR-221對AIPC發(fā)生發(fā)展的生物學意義，進行細胞學功能學檢測。以求尋找理想的診治晚期前列腺癌的有效靶標。
　　 目的:
　　 針對激素治療敏感和失效的病例標本，進行miRNA

8、芯片篩選，建立前列腺癌雄激素阻斷治療后，兩個重要階段的miRNA表達譜數(shù)據(jù)庫。通過細胞模型，明確miR-221主要參與調(diào)控細胞哪些生物學功能。尋找miR-221作用的靶蛋白，探索miR-221作用機制。探測分析miR-221及其調(diào)控的靶蛋白與雄激素非依賴前列腺癌產(chǎn)生及進展的關系。
　　 本研究利用激素依賴的LNCaP前列腺癌細胞系在體外誘導下建立激素非依賴LNCaP前列腺癌細胞亞系，模擬前列腺癌在激素剝奪治療后由激素依賴性向非依

9、賴性轉變的過程，對其發(fā)生機制進行初步探討，并為進一步深入研究激素非依賴前列腺癌的發(fā)生機理，提供一個可靠的平臺。通過對比LNCaP-AI(雄激素非依賴細胞)與LNCaP細胞中microRNA的變化，進一步闡述非雄轉化的機制。
　　 方法:
　　 1、針對ADPC和AIPC的病人組織標本各5例，篩選差異miRNA，鑒定miRNA表達差異通過Northen和RT-PCR方法，鑒定組織樣本中miRNA芯片篩選的miRNA表達存在

10、差異并探測差異大小，明確后續(xù)工作有研究價值。
　　 2、建立雄激素非依賴細胞模型，根據(jù)組織學篩選的miRNA表達譜，鑒定并比較差異miRNA在LNCaP/AI-LNCaP細胞模型和ASPC/AIPC組織表達是否平行，明確細胞模型可以用于生物學功能研究，選取表達差異大的miRNA(miR-221)進行生物學功能探索。
　　 3、建立前列腺癌細胞侵襲模型，使用細胞轉染探測分析雄激素對miR-221細胞定位及細胞生物學功能的影

11、響，深入探討miR-221在激素非依賴化轉變中的作用機制。
　　 4、通過生物信息學和miRNA數(shù)據(jù)庫，篩選miR-221作用的靶蛋白基因，確定靶基因確切結合區(qū)域或位點，經(jīng)過western blot和RT-PCR實驗，進一步明確miR-221及其調(diào)控的靶基因與疾病的關系。
　　 結果:
　　 1、利用Northern及RT-PCR方法檢測，ADPC及AIPC患者標本中差異表達的microRNA，其中表達下調(diào)的有m

12、iR-15a和miR-101，上調(diào)有miR-221，miR-222 miR-21，miR-205和miR-125b，其中miR-221上調(diào)明顯。
　　 2、利用RT-PCR檢測LNCaP-AI，LNCaP細胞系中miR-221的表達明顯升高，達10倍左右。證明miR-221在前列腺癌的雄激素非依賴轉化過程中發(fā)揮作用。
　　 3、CCK-8方法檢測轉染了miR-221的LNCaP及LNCaP-AI細胞能夠在無激素的環(huán)境下迅

13、速增殖，并且轉染了anti-miR-221的LNCaP及LNCaP-AI細胞生長則明顯受到抑制。通過流式細胞學檢測發(fā)現(xiàn)轉染了miR-221的LNCaP及LNCaP-AI細胞的S期細胞明顯升高，證明miR-221有可能促進前列腺癌細胞的分裂生長。
　　 4、通過轉染miR-221至LNCaP細胞發(fā)現(xiàn)轉染3天后LNCaP細胞出現(xiàn)神經(jīng)內(nèi)分泌型表現(xiàn)，RT-PCR檢測轉染了miR-221的LNCaP細胞中NSE的水平較對照組明顯升高，We

14、stern在蛋白水平檢測NSE蛋白也明顯高表達。提示miR-221促進前列腺癌細胞的神經(jīng)內(nèi)分泌轉化。
　　 5、劃痕實驗檢測轉染了miR-221的LNCaP-AI細胞遷移至空白區(qū)的細胞數(shù)量較對照組明顯增加，證實其遷移能力明顯增強。
　　 6、Transwell侵襲實驗發(fā)現(xiàn)轉染了anti-miR-221的LNCaP-AI細胞穿過基質(zhì)膠的細胞數(shù)量較對照組明顯升高，提示miR-221提高了LNCaP-AI細胞的侵襲能力。

15、>　　 7、通過檢索microrna.sanger.ac.uk針對miR-221尋找相關調(diào)控的靶基因DVL2，提示mi R-221通過調(diào)控DVL2從而影響前列腺癌細胞的侵襲能力。qRT-PCR方法對比LNCaP-AI與LNCaP細胞中DVL2明顯上調(diào)。通過Western檢測發(fā)現(xiàn)轉染了miR-221的LNCaP-AI細胞中DVL2相對于對照組明顯升高。提示miR-221通過調(diào)節(jié)DVL2從而改變LNCaP-AI的侵襲能力。
　　

16、8、通過收集ADPC及AIPC期患者的全血，利用RT-PCR檢測miR-221的水平，發(fā)現(xiàn)AIPC患者中miR-221的水平明顯低于ADPC患者。可以用來進行作為前列腺癌患者進展的指標。
　　 結論:
　　 1、本研究通過對于miR-221在不同前列腺癌細胞系中的功能的研究，發(fā)現(xiàn)miR-221通過增加S期細胞的數(shù)量，從而促進LNCaP及LNCaP-AI細胞的增殖。因此miR-221會在前列腺癌的生長及進展期發(fā)揮作用。同時

17、我們也證實miR-221通過增加NSE的表達促進LNCaP細胞的神經(jīng)內(nèi)分泌化的轉變。而NE的轉變則被認為是前列腺癌雄激素非依賴性轉變的重要原因。
　　 2、通過對于LNCaP及LNCaP-AI細胞轉染不同miR-221模擬物進行檢測，發(fā)現(xiàn)miR-221可以明顯提升LNCaP-AI細胞的遷移和侵襲能力。這也在一定程度上證明miR-221可以促進晚期前列腺癌的擴散。并且通過對于其靶基因的尋找發(fā)現(xiàn)DVL2可能是改變LNCaP-AI細胞