滋補腎陰法對糖皮質激素所致骨質疏松大鼠Wnt信號傳導的影響.pdf

1、目的：
　　 通過體內實驗和體外實驗，從對成骨細胞具有重要調控作用的Wnt信號通路傳導的角度，揭示滋陰補腎法治療糖皮質激素性骨質疏松癥的作用機理，并為闡明中醫(yī)“腎主骨”機理的科學內涵提供進一步的實驗依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.體內實驗：
　　 將55只雌性Wistar大鼠隨機分為4組：正常對照組12只、模型組15只、陽性對照組13只、滋補腎陰組15只。模型組大鼠肌注地塞米松0.1ml/100g體重，給

2、藥濃度為1mg/ml，給藥劑量為1mg/kg體重，每周2次，連續(xù)8w；正常對照組則相應肌注等體積的生理鹽水。陽性對照組及滋補腎陰組除按以上方法肌注地塞米松外，陽性對照組灌胃給予阿法骨化醇1ml/100g體重，給藥濃度為0.005μg，/ml，給藥劑量為0.05μg/kg體重；滋補腎陰組灌胃給予左歸丸水煎劑1ml/100g體重，給藥濃度為0.952g生藥/ml，給藥劑量為9.52g生藥/kg體重，以上給藥每天1次，每周6天，連續(xù)8w。

3、r>　　 各組大鼠于處死前16天和前3天分別腹腔注射鹽酸四環(huán)素30mg/kg體重，以對骨進行熒光標記。給藥結束后，采用大鼠麻醉后股動脈取血法，所取全血靜置1h后，經(jīng)2000rmp離心10 min后取血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測各組大鼠血清中BGP、E2、PTH、IGF—Ⅰ的水平。取血后將各組大鼠處死，取右側脛骨近端1/3，制作不脫鈣骨切片，采用骨組織形態(tài)計量學方法，檢測各組大鼠脛骨骨小梁體積百分比(TBV％)、骨小梁吸收

4、表面百分比(TRS％)、骨小梁形成表面百分比(TFS％)、骨小梁礦化率(MAR)、類皮質平均寬度(OSW)、骨皮質礦化率(mAR)，以觀察各組大鼠骨形成及骨吸收等骨代謝情況。取左側脛骨近端1/3，制作大鼠脛骨脫鈣骨的冰凍切片，分別采用免疫組化、原位雜交法檢測各組大鼠脛骨成骨細胞及骨髓基質細胞中Wntl、LRP—5及β—catenin蛋白及mRNA的表達。
　　 2.體外實驗：
　　 2.1左歸丸含藥血清的制備
　　

5、 雌性Wistar大鼠20只，隨機分為2組：正常對照組和左歸丸治療組，每組10只。左歸丸治療組大鼠：地塞米松0.1mg/100g肌注，每周2次，連續(xù)8w，然后灌服左歸丸，一日2次，連續(xù)5次，于末次給藥1h，乙醚麻醉，無菌條件下，經(jīng)腹主動脈采血，冷置1h后，離心(2500r/min，25min)，分離血清，是為左歸丸含藥血清，56℃滅活30min，—20℃冰箱保存?zhèn)溆?。正常對照組按以上程序，灌服等容積的蒸餾水，所取血清即正常對照組血清。

6、
　　 2.2 MTT法測定不同實驗條件對成骨細胞增殖的影響
　　 本實驗分為6組：成骨細胞(OB)+正常血清組，OB+10—7 mol/L地塞米松組，OB+10—8 mol/L地塞米松組，OB+5％左歸丸含藥血清組、OB+10％左歸丸含藥血清組、OB+15％左歸丸含藥血清組，每組8個樣本。將成骨細胞懸液濃度調節(jié)至為1×104/ml，將其接種至96孔細胞培養(yǎng)板，每孔200μl，培養(yǎng)12h細胞貼壁后，分別用正常對照組血清1

7、0—7 mol/L地塞米松、10—8 mol/L地塞米松、5％左歸丸含藥血清、10％左歸丸含藥血清、15％左歸丸含藥血清處理各組細胞，5％CO2，37℃繼續(xù)培養(yǎng)96h，然后用MTT法于酶標儀上檢測波長為570nm處各種細胞的OD值。
　　 2.3左歸丸含藥血清對成骨細胞Wnt3α、LRP—6、β—catenin蛋白及mRNA表達的影響
　　 本實驗分為3組：正常血清組，地塞米松組，左歸丸含藥血清組。培養(yǎng)12h后，分別用正

8、常對照組血清、10—7 mol/L地塞米松、15％左歸丸含藥血清處理各組細胞，繼續(xù)培養(yǎng)96h。隨后分別采用免疫印跡法及熒光實時定量PCR(Realtime PCR.)技術檢測各組細胞中Wnt3α、LRP—6、β—catenin蛋白及mRNA的表達。
　　 3統(tǒng)計學分析
　　 以上實驗結果皆以均數(shù)±標準差((x)±s)表示，采用單因素方差分析(ANOVA)進行數(shù)據(jù)處理，組間兩兩比較，采用q檢驗。
　　 結論：

9、>　　 滋補腎陰法對糖皮質激素所致大鼠的骨質疏松癥具有明顯的治療作用，其作用途徑有三：第一，促進成骨細胞的增殖，進而使骨形成增加。第二，使Wnt信號傳導通路的關鍵信號分子——Wnt、LRP及β—catenin的表達上調。具體途徑是，增強Wnt信號，使其與受體LRP的結合增多，則β—catenin蛋白不會被降解而在胞內聚集，從而可以進入細胞核內，與轉錄因子TCF結合激活基因轉錄過程。這一方面促進了成骨細胞的定向、分化、發(fā)育、增殖，并抑制