WHV-HBV嵌合病毒復制型克隆構建及其持續(xù)復制小鼠模型的建立.pdf

1、目的：
　　1.用HBV基因組編碼HBsAg的堿基序列替換WHV基因組中相應的同源序列,構建WHV-HBV嵌合病毒可復制性克隆。
　　2.通過尾靜脈高壓水注射的方法,建立WHV-HBV嵌合病毒持續(xù)復制小鼠模型。了解WHV-HBV嵌合小鼠體內(nèi)的免疫應答,探索持續(xù)復制的機制。
　　3.研究HBsAgDNA疫苗在WHV-HBV嵌合病毒小鼠模型上的免疫保護效力。
　　方法：
　　1.以本實驗室構建的pBS-WHV1

2、.3和pBS-HBV1.3為模板,利用分子克隆技術,用HBV基因組中編碼S區(qū)“a”抗原決定簇、Major HBsAg、Middle HBsAg的堿基序列替換 WHV基因組中對應的同源序列。構建成功的嵌合WHV-HBV質(zhì)粒,通過體外轉染Huh7、HepG2細胞,酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測轉染細胞上清中的HBsAg。
　　2.采用高壓尾靜脈注射的方式將pBS-WHV1.3、WHV-HBV-Sa、WHV-HBV-SS、WHV-H

3、BV-MS克隆轉染到BALB/c小鼠肝臟內(nèi),定期采集小鼠血清和肝臟標本,通過酶聯(lián)免疫吸附實驗、PCR、Southern Blot及免疫組織化學染色等方法監(jiān)測小鼠體內(nèi)病毒血癥。尾靜脈注射36周后,用酶聯(lián)免疫斑點實驗(ELISPOT)和細胞內(nèi)因子染色實驗,檢測在HBsAg和WHcAg的H-2kd CTL表位肽、HBsAg H-2kd CD4表位肽及HBsAg、WHcAg刺激下,抗原特異性CTL和CD4細胞免疫應答。
　　3.將pcDN

4、A3.1-HBsAg質(zhì)粒采用肌肉注射聯(lián)合電擊免疫小鼠,完成免疫周期后2周,尾靜脈高壓水注射pBS-HBV1.3、WHV-HBV-Sa、WHV-HBV-SS、WHV-HBV-MS,采集系列血清檢測 HBsAg、HBsAb,PCR檢測血清中病毒DNA,免疫組化檢測核心抗原的表達。
　　結果：
　　1.構建WHV-HBV嵌合質(zhì)粒WHV-HBV-Sa、WHV-HBV-SS、WHV-HBV-MS,測序結果顯示,成功的實現(xiàn)了預期的基因組

5、替換。分別轉染Huh7和HepG2細胞后,轉染W(wǎng)HV1.3和Sa的細胞上清中未能檢測到HBsAg,轉染SS和MS的細胞上清中均可檢測到HBsAg。
　　2.在高壓尾靜脈注射WHV1.3后1天,9只小鼠中有2只病毒DNA為弱陽性。注射后1018天,所有小鼠的血清病毒 DNA都呈陽性,并持續(xù)到45周。肝臟中可檢測到WHcAg和WHsAg,WHcAg陽性細胞數(shù)從尾注后第10天的5％逐漸下降,到98天約為2％。Sa注射小鼠中,67％小鼠的

6、血清用HBsAg酶聯(lián)免疫實驗檢測為陽性,并持續(xù)陽性到45周。WHV DNA在小鼠血清中持續(xù)低水平存在。肝臟中WHcAg表達與WHV1.3組相似。高壓尾靜脈注射SS MS的小鼠中,注射后第1天,即可檢測到HBsAg。4周后陸續(xù)轉為陰性值。但是,值得注意的是 MS組有兩只小鼠血清HBsAg持續(xù)陽性到36周。小鼠血清中病毒DNA呈低水平持續(xù)存在。在SS和MS高壓尾靜脈注射的小鼠肝組織中均可檢測到WHcAg。在體外,通過特異性抗原和肽段刺激小鼠

7、脾臟淋巴細胞,細胞內(nèi)因子染色實驗未得到陽性結果,Elispot檢測僅有兩只小鼠有針對HBsAg的陽性反應。
　　3.小鼠經(jīng)pcDNA3.1-HBsAg三次電擊免疫后,體內(nèi)產(chǎn)生anti-HBs。經(jīng)免疫小鼠與對照小鼠,尾靜脈高壓水注射Sa、SS、MS、pBS-HBV1.3,經(jīng)免疫的小鼠血清中的HBsAg、病毒DNA均較快被清除,對照小鼠的血清HBsAg和病毒DNA仍然持續(xù)陽性。
　　結論：
　　1.成功構建WHV-HBV嵌

8、合可復制性克隆WHV-HBV-Sa、WHV-HBV-SS、WHV-HBV-MS。
　　2.野生型和嵌合WHV基因組可以在高壓尾靜脈注射小鼠體內(nèi)持續(xù)表達WHV和HBV蛋白。但是,復制能力低于HBV基因組。一個主要的允許WHV基因組持續(xù)的因素是缺乏針對WHV和HBV蛋白的免疫反應。
　　3.針對HBsAg的早期免疫可以有效的阻止嵌合WHV基因組的表達和持續(xù)。
　　本研究的創(chuàng)新點及意義:
　　1.通過分子克隆技術,構建

9、了WHV-HBV嵌合病毒可復制性克隆。
　　2.的結果提示,在高壓尾靜脈注射小鼠模型中,除了載體和宿主遺傳背景因素,病毒因素也是病毒持續(xù)的決定性因素。
　　3.構建成功的WHV-HBV嵌合病毒,將進一步感染土撥鼠,建立WHV-HBV嵌合重組病毒感染的土撥鼠模型,使土撥鼠模型在HBV的研究中更具實際應用價值。將為揭示HBV特異性的免疫應答特征,研究HBV急、慢性感染的發(fā)病機制,篩選慢性乙肝治療藥物和各種免疫調(diào)節(jié)手段提供一個新的