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文檔簡介
1、目的:觀察TLR9在STZ誘導的糖尿病大鼠脾臟和胰腺中的表達,在不同濃度CpG-ODN激活下,TLR9及其下游信號分子的表達的改變,血清Th1類細胞因子TNF-α、IFN-γ和Th2類細胞因子IL-6的水平變化。探討CpG-ODN對STZ誘導的糖尿病大鼠TLR9-MyD88通路的影響。
方法:1.取5~6周齡SD雄性大鼠40只,隨機分為四組:正常對照組(Ⅰ組),實驗對照組(Ⅱ組),低劑量CpG-ODN組(Ⅲ組),高劑量CpG-
2、ODN組(Ⅳ組)。誘導建立1型糖尿病SD大鼠模型采用腹腔注射STZ的方法。除Ⅰ組外,其余3組大鼠均按照60 mg/kg·bw行腹腔注射STZ,注射72h后檢測大鼠空腹血糖值。在第-1 d,2d,5d,8d,14d天分別給Ⅲ、Ⅳ組SD大鼠注射60μg/kg·bwCpG-ODN和120μg/kg·bw CpG-ODN,第15d時處死所有大鼠。2.取胰腺,脾臟,組織切片,HE染色觀察胰腺組織。3.熒光定量PCR檢測大鼠脾臟TLR9mRNA、M
3、yD-88 mRNA、NF-κB mRNA和Western blotting法分析脾臟、胰腺組織TLR9、NF-κB蛋白表達改變。4.采用ELISA法測定血清TNF-α,IL-6,IFN-γ水平的變化。
結果:1.SD大鼠注射STZ24 h后血糖開始升高,3d后“三多一少”癥狀明顯,7d后造模組隨機血糖為(Ⅱ組25.28±5.06 mmol/L,Ⅲ組25.87±1.39 mmol/L,Ⅳ組25.72±4.52 mmol/L),
4、正常對照組(Ⅰ組)隨機血糖為(5.88±0.66 mmol/L),實驗組SD大鼠空腹血糖均>11.1 mmol/L。第15d時大鼠體重,模型組為(Ⅱ組173.73±5.169,Ⅲ組179.10±3.679,Ⅳ組158.40±8.369),正常對照組Ⅰ組為(315.20±9.529)。2.胰腺組織病理切片,HE染色后:Ⅰ組胰島包膜完整,與周圍分界清楚,細胞分散均勻,未見炎癥細胞浸潤;Ⅱ組胰島形態(tài)輕微改變,細胞間隙增加,細胞分布不均勻,有淋
5、巴細胞浸潤;Ⅲ組胰島形態(tài)較大改變,細胞間隙擴張水腫,有大量淋巴細胞浸潤;Ⅳ組胰島形態(tài)很大程度改變,有萎縮現(xiàn)象,細胞分散,有大量淋巴細胞浸潤。3.實時熒光定量PCR結果顯示:與正常對照組比,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ組大鼠脾臟TLR9mRNA,MyD88 mRNA,NF-κB mRNA的表達有明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.01)。在CpG-ODN刺激下,Ⅲ,Ⅳ組TLR9mRNA,MyD88 mRNA,NF-κB mRNA的表達較Ⅱ組也有明顯升高,
6、差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。Ⅳ和Ⅲ組比較,TLR9 mRNA,NF-κB mRNA的表達量顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05),而MyD88 mRNA兩組比較結果差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。4.Western blotting結果顯示:與正常對照組比較,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組TLR9和NF-κB(p65)蛋白的表達均明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。CpG-ODN刺激下,Ⅲ,Ⅳ組TLR9蛋白的表達較Ⅱ組明顯升高,
7、差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。Ⅳ組較Ⅲ組,蛋白表達顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。5.血清細胞因子測定結果表明:Th1類細胞因子TNF-α和IFN-γ,Ⅱ組和Ⅰ組比較,雖有升高趨勢,但無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。經不同濃度CpG-ODN刺激后,Ⅲ,Ⅳ組與Ⅱ組比較,表達都有顯著性升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),且Ⅲ和Ⅳ組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而以IL-6為代表的Th2類細胞因子,Ⅱ組和Ⅰ組
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