CpG-ODN對STZ誘導的糖尿病大鼠TLR9-MyD88通路的影響.pdf

1、目的:觀察TLR9在STZ誘導的糖尿病大鼠脾臟和胰腺中的表達，在不同濃度CpG-ODN激活下，TLR9及其下游信號分子的表達的改變，血清Th1類細胞因子TNF-α、IFN-γ和Th2類細胞因子IL-6的水平變化。探討CpG-ODN對STZ誘導的糖尿病大鼠TLR9-MyD88通路的影響。
　　方法:1.取5～6周齡SD雄性大鼠40只，隨機分為四組:正常對照組（Ⅰ組），實驗對照組（Ⅱ組），低劑量CpG-ODN組（Ⅲ組），高劑量CpG-

2、ODN組(Ⅳ組)。誘導建立1型糖尿病SD大鼠模型采用腹腔注射STZ的方法。除Ⅰ組外，其余3組大鼠均按照60 mg/kg·bw行腹腔注射STZ，注射72h后檢測大鼠空腹血糖值。在第-1 d，2d，5d，8d，14d天分別給Ⅲ、Ⅳ組SD大鼠注射60μg/kg·bwCpG-ODN和120μg/kg·bw CpG-ODN，第15d時處死所有大鼠。2.取胰腺，脾臟，組織切片，HE染色觀察胰腺組織。3.熒光定量PCR檢測大鼠脾臟TLR9mRNA、M

3、yD-88 mRNA、NF-κB mRNA和Western blotting法分析脾臟、胰腺組織TLR9、NF-κB蛋白表達改變。4.采用ELISA法測定血清TNF-α，IL-6，IFN-γ水平的變化。
　　結果:1.SD大鼠注射STZ24 h后血糖開始升高，3d后“三多一少”癥狀明顯，7d后造模組隨機血糖為（Ⅱ組25.28±5.06 mmol/L，Ⅲ組25.87±1.39 mmol/L，Ⅳ組25.72±4.52 mmol/L），

4、正常對照組（Ⅰ組）隨機血糖為（5.88±0.66 mmol/L），實驗組SD大鼠空腹血糖均＞11.1 mmol/L。第15d時大鼠體重，模型組為(Ⅱ組173.73±5.169，Ⅲ組179.10±3.679，Ⅳ組158.40±8.369)，正常對照組Ⅰ組為（315.20±9.529）。2.胰腺組織病理切片，HE染色后:Ⅰ組胰島包膜完整，與周圍分界清楚，細胞分散均勻，未見炎癥細胞浸潤;Ⅱ組胰島形態(tài)輕微改變，細胞間隙增加，細胞分布不均勻，有淋

5、巴細胞浸潤;Ⅲ組胰島形態(tài)較大改變，細胞間隙擴張水腫，有大量淋巴細胞浸潤;Ⅳ組胰島形態(tài)很大程度改變，有萎縮現(xiàn)象，細胞分散，有大量淋巴細胞浸潤。3.實時熒光定量PCR結果顯示:與正常對照組比，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ組大鼠脾臟TLR9mRNA，MyD88 mRNA，NF-κB mRNA的表達有明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.01）。在CpG-ODN刺激下，Ⅲ，Ⅳ組TLR9mRNA，MyD88 mRNA，NF-κB mRNA的表達較Ⅱ組也有明顯升高，

6、差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。Ⅳ和Ⅲ組比較，TLR9 mRNA，NF-κB mRNA的表達量顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05），而MyD88 mRNA兩組比較結果差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。4.Western blotting結果顯示:與正常對照組比較，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組TLR9和NF-κB(p65)蛋白的表達均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。CpG-ODN刺激下，Ⅲ，Ⅳ組TLR9蛋白的表達較Ⅱ組明顯升高，

7、差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。Ⅳ組較Ⅲ組，蛋白表達顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。5.血清細胞因子測定結果表明:Th1類細胞因子TNF-α和IFN-γ，Ⅱ組和Ⅰ組比較，雖有升高趨勢，但無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。經不同濃度CpG-ODN刺激后，Ⅲ，Ⅳ組與Ⅱ組比較，表達都有顯著性升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，且Ⅲ和Ⅳ組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。而以IL-6為代表的Th2類細胞因子，Ⅱ組和Ⅰ組