白紋伊蚊Rh類糖蛋白基因的克隆與生物學(xué)特性研究.pdf

1、蚊是非自育昆蟲，雌蚊需要吸取脊椎動(dòng)物的血液才能產(chǎn)卵。雌蚊的嗜血特性使其頻繁接觸宿主，從而成為許多疾病的傳播媒介，如瘧疾、登革熱、流行性乙型腦炎、黃熱病等，嚴(yán)重威脅人類健康。因此，深入開展蚊蟲的生物學(xué)特性研究，闡明雌蚊血餐代謝的分子機(jī)制，有助于發(fā)現(xiàn)新型殺蟲劑作用靶標(biāo)，探索新的蚊蟲控制策略。
　　 嗜血雌蚊攝入宿主的血液是自身體重的2倍，血餐中含有大量蛋白質(zhì)，其中60％以上蛋白氨基酸被脫氨基氧化供能，只有3％參與卵蛋白的合成，其它被

2、用于合成卵脂類、自身蛋白和能量?jī)?chǔ)存。食物氨基酸脫氨基過程中產(chǎn)生的氨的代謝平衡對(duì)于維持蚊蟲正常的生理功能極為重要。而血餐后24小時(shí)雌蚊血淋巴內(nèi)的銨離子濃度僅增加了1.3mM，提示在大規(guī)模的脫氨基作用中，雌蚊代謝氨的能力巨大，足以維持血淋巴內(nèi)的低銨離子濃度。
　　 氨在細(xì)菌中含量豐富，銨離子通道在植物、微生物攝取和同化氮的過程中起關(guān)鍵作用，使得細(xì)菌和酵母能夠在氨氣存在的情況下存活，并將它作為唯一氮源。酵母和哺乳動(dòng)物中的銨離子通道家族

3、成員分別為甲銨透酶(methylaminepermeases，Mep)和Rh類糖蛋白(Rhesus-like glycoprotein)。目前已有3個(gè)哺乳動(dòng)物銨離子通道家族成員被分離鑒定：RhAG(Rhesus-associated glycoprotein)；RhBG(Rhesus B glycoprotein)和RhCG(Rhesus C glycoprotein)。然而迄今為止，蚊體內(nèi)的銨離子通道的同類物還知之甚少。
　　

4、 我們對(duì)GenBank中各種蚊蟲的核酸序列掃描結(jié)果顯示：岡比亞按蚊、致倦庫(kù)蚊和埃及伊蚊均存在Rh類糖蛋白，其氨基酸序列與鼠Rhbg、人RhBG、果蠅Rh50類糖蛋白的一致性為45-77％。生物信息學(xué)分析提示：蚊Rh類糖蛋白可能是重要的銨離子通道超家族成員。目前，Rh類糖蛋白在蚊體內(nèi)的分布、作用及功能位點(diǎn)尚無所知，對(duì)這些內(nèi)容進(jìn)行全面研究將有助于新型殺蟲劑作用靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)。因此，本課題以登革熱的重要媒介白紋伊蚊為研究對(duì)象，克隆其Rh類糖蛋白(

5、Aedes albopictus Rhesus-like glycoprotein，AaRh)基因的全長(zhǎng)cDNA，確定該蛋白的組織分布和作用特性，鑒定蚊類銨離子通道超家族成員。
　　 研究方法：
　　 1.AaRh全長(zhǎng)cDNA序列的獲得及其生物信息學(xué)分析
　　 1.1應(yīng)用簡(jiǎn)并引物RT-PCR獲取白紋伊蚊Rh類糖蛋白的基因片段
　　 根據(jù)岡比亞按蚊、埃及伊蚊等親緣關(guān)系較近物種的Rh類糖蛋白同源性分析結(jié)果，我

6、們分別在184/343和219/339氨基酸位點(diǎn)設(shè)計(jì)2對(duì)簡(jiǎn)并引物，以白紋伊蚊雌蚊總RNA為模板，合成cDNA第一鏈，應(yīng)用巢式PCR擴(kuò)增AaRh的基因片段。
　　 1.2應(yīng)用RACE方法獲取AaRh基因的全長(zhǎng)cDNA序列
　　 根據(jù)獲得的AaRh基因部分序列，設(shè)計(jì)2對(duì)特異性引物AaRh GSP1、GSP2和AaRh GSP3、GSP4，應(yīng)用5'RACE和3'RACE分別擴(kuò)增AaRh基因的5'端和3'端cDNA片段，然后拼接

7、出全長(zhǎng)cDNA序列。
　　 1.3 AaRh核苷酸序列及推測(cè)的氨基酸序列生物信息學(xué)分析
　　 通過NCBI網(wǎng)站的BLASTx程序(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，將目的基因序列與GenBank中的相關(guān)序列進(jìn)行比對(duì)，判斷該基因是否是全長(zhǎng)基因，并推導(dǎo)氨基酸序列。通過蛋白分析專家系統(tǒng)Expasy(http：/www.expasy.org/)所提供的蛋白質(zhì)序列分析工具：ProtParam程

8、序預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，包括分子量、等電點(diǎn)、氨基酸組成、在溶液中的穩(wěn)定性等；PROSITE motif程序預(yù)測(cè)一級(jí)結(jié)構(gòu)中糖基化、脂酰化、磷酸化等修飾位點(diǎn)和模序；SignalP程序分析分泌信號(hào)肽特征序列；InterPro Scan程序掃描一級(jí)結(jié)構(gòu)中包含的結(jié)構(gòu)和功能域特征序列；SOSUI程序預(yù)測(cè)AaRh蛋白的跨膜區(qū)、拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)等二級(jí)結(jié)構(gòu)。通過在線生物信息學(xué)軟件EMBOSS(http：//bioweb.pasteur.fr/seqanal/EM

9、BOSS)預(yù)測(cè)線性抗原決定簇和氨基酸的親水性。利用CLUSTALW程序?qū)Π准y伊蚊AaRh與GenBank中其它物種的同源蛋白序列進(jìn)行比對(duì)分析，構(gòu)建分子進(jìn)化樹。
　　 2.AaRh的組織定位和血餐誘導(dǎo)表達(dá)分析
　　 2.1構(gòu)建pEGFP-AaRh真核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞
　　 根據(jù)AaRh mRNA ORF序列，分別在起始密碼子后(包括起始密碼子)和終止密碼子前(不包括終止密碼子)設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，擴(kuò)增Aa

10、Rh全長(zhǎng)cDNA。通過雙酶切真核熒光表達(dá)載體pEGFP-N1和AaRh全長(zhǎng)cDNA、連接等分子克隆步驟，構(gòu)建pEGFP-AaRh重組質(zhì)粒。將pEGFP-AaRh和pEGFP-N1分別轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，24h、48h、72h后在熒光顯微鏡下觀察、照像。
　　 2.2白紋伊蚊C6/36細(xì)胞內(nèi)AaRh mRNA的鑒定
　　 根據(jù)AaRh mRNA全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)莖環(huán)結(jié)構(gòu)的分子信標(biāo)探針，轉(zhuǎn)染白紋伊蚊C6/36細(xì)胞，4h后行熒光顯微鏡

11、觀察、照像。
　　 2.3AaRh蛋白在白紋伊蚊雌蚊的免疫組織定位
　　 根據(jù)AaRh氨基酸序列抗原表位預(yù)測(cè)結(jié)果，選取兩個(gè)可能的抗原表位363-376aa和433-446aa，人工合成兩段多肽，分別與載體KLH偶聯(lián)后免疫家兔制備抗血清。制備白紋伊蚊雌蚊的石蠟切片，通過免疫組化方法確定AaRh蛋白的組織分布。
　　 2.4 AaRh基因在蚊各發(fā)育階段及血餐前后的時(shí)空表達(dá)模式
　　 以SYBR Green為熒

12、光染料，AaRh GSP1、GSP2為特異性引物，應(yīng)用熒光定量RT-PCR確定AaRh基因在蚊蟲不同發(fā)育階段(卵、幼蟲、蛹)的表達(dá)水平；雌蚊不同組織(頭、胸、脂肪體、中腸、馬氏管、卵巢)在血餐前后不同時(shí)間點(diǎn)的AaRh轉(zhuǎn)錄水平。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.AaRh基因全長(zhǎng)cDNA序列的獲得及其生物信息學(xué)分析
　　 應(yīng)用2對(duì)簡(jiǎn)并引物進(jìn)行巢式PCR，獲得379bp AaRh基因片段。應(yīng)用5'RACE和3'RACE方法

13、，分別獲得AaRh基因5'端1008 bp、3'端822 bp cDNA序列，根據(jù)兩個(gè)片段的首/尾共同序列拼接為1717bp的基因片段。將該核苷酸序列在GenBank中進(jìn)行BLASTn分析，結(jié)果顯示AaRh與埃及伊蚊Rh50-GP1、埃及伊蚊Rh抗原、埃及伊蚊Rh50-GP2、致倦庫(kù)蚊Amt1的核苷酸一致性分別為84％、87％、81％和77％。AaRh基因具有完整的開放閱讀框，其ORF從第128位到1516位含1389bp，起始密碼子為

14、ATG，終止密碼子為TAG，編碼462個(gè)氨基酸。在5'端和3'端分別有127 bp、201 bp的非翻譯區(qū)。
　　 通過在線生物信息學(xué)軟件分析(Expasy和NCBI)，白紋伊蚊Rh類糖蛋白是一個(gè)整合膜蛋白，跨膜11次，58aa-446aa具有銨離子通道的結(jié)構(gòu)功能域；理論等電點(diǎn)(pI)5.37，分子量(Mw)49775.10 Dalton，1aa-26aa可能為分泌信號(hào)肽序列；含有4個(gè)潛在的天冬酰胺糖基化位點(diǎn)，翻譯后可能進(jìn)行糖基

15、化修飾，提示其為糖蛋白；EMBOSS預(yù)測(cè)其有17個(gè)線性抗原決定簇。同源性分析結(jié)果顯示白紋伊蚊Rh類糖蛋白與埃及伊蚊Rh蛋白的一致性高達(dá)95％。綜合以上分析結(jié)果，我們推測(cè)AaRh可能是銨離子通道家族的新成員。
　　 2.AaRh的組織定位和血餐誘導(dǎo)表達(dá)分析
　　 成功構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-AaRh，與綠色熒光蛋白融合的重組白紋伊蚊Rh類糖蛋白在Hela細(xì)胞的胞膜表達(dá)，顯示其是膜蛋白。應(yīng)用分子信標(biāo)探針鑒定AaRh mR

16、NA在白紋伊蚊C6/36細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，提示其在蚊胸肌細(xì)胞正常代謝活動(dòng)中的重要性。通過免疫組化方法確定AaRh蛋白主要分布于白紋伊蚊雌蚊的頭、胸、脂肪體和馬氏管，在中腸、卵巢分布較少。
　　 應(yīng)用熒光定量RT-PCR確定AaRh基因在白紋伊蚊的卵、幼蟲、蛹、成蚊各個(gè)發(fā)育階段均有較高水平表達(dá)；在羽化3天飼糖雌蚊的頭和馬氏管表達(dá)水平最高，其次為胸，在脂肪體、中腸和卵巢表達(dá)較少。雌蚊血餐后3h，中腸、脂肪體、馬氏管的AaRh mRNA表達(dá)

17、水平逐漸增加，胃血消化結(jié)束后逐漸下降，恢復(fù)至血餐前水平。中腸、脂肪體、馬氏管是雌蚊血餐后氨代謝活躍的場(chǎng)所，因此明顯提示AaRh蛋白可能是蚊蟲銨離子通道家族成員。
　　 研究結(jié)論：
　　 1.我們成功獲得白紋伊蚊Rh類糖蛋白基因的全長(zhǎng)cDNA序列，通過生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)其理化性質(zhì)、拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)、保守功能域等，推測(cè)其為銨離子通道家族成員。
　　 2.與綠色熒光蛋白融合的重組AaRh蛋白在Hela細(xì)胞的胞膜表達(dá)，顯示其膜

18、蛋白特性。分子信標(biāo)探針鑒定AaRh mRNA在白紋伊蚊胸肌C6/36活細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，免疫組化方法確定AaRh蛋白主要分布于白紋伊蚊雌蚊的頭、胸、脂肪體和馬氏管，在中腸和卵巢分布較少。熒光定量RT-PCR方法確定AaRhmRNA在羽化3天飼糖雌蚊的腦、馬氏管含量最高，其次是胸，在脂肪體、中腸和卵巢含量較少。雌蚊血餐后中腸、脂肪體、馬氏管的AaRh mRNA表達(dá)水平增加，與銨離子通道功能相一致。因此，我們認(rèn)為白紋伊蚊Rh類糖蛋白很可能是蚊蟲銨