重組人腫瘤壞死因子α影響人臍靜脈內皮細胞活性及表達PD-L1蛋白表達的研究.pdf

1、研究背景：
　　 冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(CHD)是指冠狀動脈粥樣硬化使冠脈血管腔狹窄或阻塞，導致心肌缺血缺氧或壞死而引起的疾病，是動脈粥樣硬化導致器官病變的最常見類型，發(fā)病率在我國呈逐年攀升趨勢，是嚴重危害人類健康的常見病。本病由多種原因綜合所致，與年齡、性別、血壓、血脂、血糖、遺傳等多種因素相關，因此，本病病因及發(fā)病機制成為近幾十年來醫(yī)學研究的熱點。早期研究中，人們發(fā)現動脈血管內膜形成粥樣斑塊是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(C

2、HD)的主要發(fā)病原因，病變特征是血中脂質在動脈內膜沉積，引起內膜局灶性纖維性增厚及其深部成分的壞死、崩解，形成粥樣物，所以早期研究者認為動脈粥樣硬化是因脂質沉淀于血管內皮所致，即傳統(tǒng)的脂質沉淀理論。血脂增高被認為是冠心病的重要高危因素，但統(tǒng)計發(fā)現僅有約50％的冠心病患者表現為血脂增高。進一步研究表明，動脈粥樣硬化不僅是一種單純的脂肪沉積疾病，機體的慢性炎癥機制在粥樣硬化斑塊的形成及發(fā)展中起著關鍵作用。上世紀九十年代Dr.Russell

3、Ross首次提出了“損傷反應”理論，認為動脈粥樣硬化是多種損傷因素導致的發(fā)生在血管內膜的慢性炎癥反應，該理論使得人們對于動脈粥樣硬化機制的認識有了質的提高。Dr.Russell Ross認為，動脈粥樣硬化早期斑塊形成始于一系列機械學和生化學刺激引起的功能性或者形態(tài)學內皮損傷，細胞粘附分子表達增加，合成細胞因子如白介素-8(IL-8)、單核細胞趨化因子-1(MCP-1)等，單核及巨噬細胞隨后被激活并聚集在動脈壁，接下來，脂肪積聚、生長因子

4、和細胞因子進一步釋放以及平滑肌細胞和淋巴細胞激活增生。伴隨著這些過程的繼續(xù)，粥樣斑塊逐漸成長和成熟。當富含脂肪的細胞死亡，便形成斑塊的核心部分，導致斑塊重構和纖維化或者最終破裂，血小板在內皮細胞破損處聚集，形成血栓，常常導致急性冠脈綜合征。總之，巨噬細胞、內皮細胞、平滑肌細胞、血小板以及這些細胞釋放的各種因子（如細胞素、生長因子、腫瘤壞死因子和氧自由基等）介導的炎癥反應機制參與了動脈粥樣硬化的發(fā)生，促進了AS的發(fā)展、惡化。炎癥反應在動脈

5、粥樣硬化過程中起到了關鍵作用，并與疾病預后有關。
　　 研究證實，動脈粥樣斑塊內炎癥反應非常活躍，有大量的單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞和T淋巴細胞等炎癥細胞浸潤，活動性炎癥反應亦可促使穩(wěn)定性粥樣斑塊轉變?yōu)椴环€(wěn)定性斑塊，這是冠狀動脈內急性血栓形成的誘因。因此我們認為，阻斷血管內皮的炎癥反應或許可以成為冠狀動脈粥樣硬化性疾病的預防和治療途徑。
　　 程序性死亡因子配體1(programmed cell death liga

6、nd1，PD-L1、B7-H1或CD274)是由290個氨基酸構成的Ⅰ型跨膜蛋白。最初因為被發(fā)現在腫瘤細胞中高表達，人們推測其與腫瘤細胞浸潤有關，但隨著研究的深入，發(fā)現除腫瘤細胞以外，PD-L1在多種組織細胞和炎癥細胞上均有表達，如血管內皮細胞、Kupffer細胞、星形細胞、樹突狀細胞、骨髓源性肥大細胞、胎盤合體滋養(yǎng)層細胞、淋巴細胞、巨噬細胞等;PD-L1的功能除與腫瘤細胞浸潤相關以外，也與多種病理過程有著密切的關系，如移植免疫反應、自

7、身免疫性疾病、微生物感染等。近年來多項研究認為，PD-L1作為B7家族分子的成員，其受體為程序性死亡因子1(programmed cell death1 receptor，PD-1或CD279)。PD-1的胞漿區(qū)尾部有2個酪氨酸殘基，N端酪氨酸殘基參與構成一個免疫受體酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine based inhibitory motif，ITIM)，C端酪氨酸殘基則參與構成一個免疫受體酪氨酸轉換基序

8、(immunoreceptor tyrosine-based switch motif,ITSM)，其中ITSM高度保守，提示其具有重要功能。研究表明，當PD-1與其配體結合時，ITSM發(fā)生磷酸化，通過一系列的生化過程使下游的效應分子去磷酸化，發(fā)揮負性調節(jié)作用。PD-L1是PD-1的配體之一，與PD-1結合后發(fā)揮免疫調控作用。相關研究表明，PD-1/PD-L1信號系統(tǒng)對免疫機能的調節(jié)作用，與動脈粥樣硬化的慢性炎癥機制同樣相關。Gotsm

9、an等研究冠狀動脈斑塊時，發(fā)現用熒光免疫技術可以探測到PD-L1表達于多處動脈粥樣斑塊內。從PD-L1、PD-L2、LDL受體三種基因均敲除(triple knockout，TKO)小鼠體內分離的APC能更強的刺激T細胞對ox-LDL的炎癥反應，與LDL受體敲除的小鼠相比，TKO小鼠主動脈弓、降主動脈的AS損傷區(qū)域增加了3倍。Lee等研究者發(fā)現冠心病患者外周血T淋巴細胞PD-1表型及樹突狀細胞PD-L1表型均較健康人的明顯降低。本課題組

10、的前期研究表明，穩(wěn)定性心絞痛及急性冠脈綜合癥患者外周血T淋巴細胞PD-L1蛋白表達均較正常對照組明顯增加，由此推測PD-L1可能在動脈粥樣硬化斑塊形成過程中發(fā)揮了重要作用。
　　 目前為止，細胞表達PD-L1蛋白以及PD-L1蛋白發(fā)揮免疫調控作用的完整機制仍未完全清晰，不同研究對象及使用不同刺激物，得出結果不盡相同，歸納起來，影響PD-L1表達的細胞信號通路可能為JAK/STAT信號通路、PI3K/Akt信號通路、MEK/Erk

11、信號通路、NPM/ALK通路、MAPK通路等，并且與IRF-1和STAT-3轉錄因子有關。p38MAPK信號通路是MAPK通路的重要分支，它通過使轉錄因子磷酸化而改變基因的表達，參與多種細胞內信息傳遞過程，能對廣泛的細胞外信號發(fā)生反應，介導細胞生長、發(fā)育、分化及死亡的全過程。本課題組前期研究結果表明，p38MAPK通路參與了樹突狀細胞分化表達PD-L1蛋白的調控過程，但是對于動脈粥樣硬化過程啟動并發(fā)展至關重要的血管內皮細胞，尚無相關研究

12、。鑒于此，本課題以體外培養(yǎng)臍靜脈內皮細胞為研究對象，利用炎癥因子TNF-α刺激模擬炎癥過程，觀察臍靜脈內皮細胞表達PD-L1的變化，首先明確TNF-α對臍靜脈內皮細胞PD-L1蛋白表達的影響;再以p38蛋白特異性抑制劑SB203580阻斷p38MAPK通路，重復TNF-α刺激，觀察臍靜脈內皮細胞表達PD-L1與p38MAPK信號通路的關系，探討TNF-α誘導臍靜脈內皮細胞表達PD-L1蛋白的細胞分子機制，研究負性協同刺激信號系統(tǒng)(PD-

13、1/PD-L)調控慢性炎癥過程的機理，為動脈粥樣硬化的免疫機制研究提供理論基礎。
　　 第一部分 TNF-α刺激導致臍靜脈內皮細胞存活率下降
　　 目的：觀察不同濃度的TNF-α對臍靜脈內皮細胞活性的影響，篩選出對臍靜脈內皮細胞有效且組間有統(tǒng)計學差異的TNF-α濃度梯度。
　　 對象和方法：
　　 1.對象體外培養(yǎng)的健康人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)
　　 2.方法
　　 2.1臍靜脈內

14、皮細胞的分離培養(yǎng)和鑒定
　　 無菌條件下取新生兒臍帶約25厘米（中山大學第一附屬醫(yī)院提供，產婦知情同意，過程符合赫爾辛基宣言中的倫理學標準），剪去兩端夾痕，擠出臍帶內殘留血液，PBS反復沖洗至沖洗液無色。夾緊血管下端，從上端注入0.1％膠原酶Ⅰ與含EDTA的胰蛋白酶(0.125％)消化獲取臍靜脈內皮細胞，PBS離心沖洗兩遍洗去胰蛋白酶，用臍靜脈內皮細胞專用培養(yǎng)基將細胞接種于25cm2細胞培養(yǎng)瓶，置于恒溫培養(yǎng)箱中(37℃，5％CO

15、2)培養(yǎng)，每12小時顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及貼壁狀況，每48小時全量換培養(yǎng)基。約72小時后細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底，單層均勻排布，呈典型鋪路石樣。棄去培養(yǎng)基，PBS沖洗，胰蛋白酶消化，收獲細胞并傳代培養(yǎng)。試驗所用細胞為第3-5代，內皮細胞鑒定采用Ⅷ因子相關抗原熒光染色。
　　 臍靜脈內皮細胞專用培養(yǎng)基成分(每100ml培養(yǎng)基含:FBS20ml(20％) fromGibicol; Beta-ECGF5ng/ml from sigma; L-

16、glutamine,1 mM; Penicillin-Streptomycin; heparin2500U/100ml; M-19980ml from Gibicol。)
　　 2.2臍靜脈內皮細胞凍存?zhèn)溆?br>　　 至第3代細胞培養(yǎng)至對數生長期，棄去上層培養(yǎng)基，貼壁的臍靜脈內皮細胞用無Ca2+、Mg2+的PBS輕柔沖洗2次以除去培養(yǎng)基成分，在每個培養(yǎng)瓶中加入含EDTA的濃度為0.125％胰蛋白酶消化細胞，顯微鏡下觀察，待細

17、胞由梭形回縮至球形時加入血清終止消化，PBS再次沖洗兩遍，加入成分為20％FBS、10ng/mLβ-ECGF、25U/mL肝素的M199培養(yǎng)基3ml，反復吹打至臍靜脈內皮細胞脫離瓶壁懸浮于培養(yǎng)基中，調整細胞濃度至105個/ml，吸取3ml用于細胞鑒定及Cell Counting Kit-8(CCK-8)細胞活性檢測試驗，其余細胞經1000轉/min、5min離心后，棄去上層培養(yǎng)基，加凍存液凍存于液氮中備用。凍存液配制:85％M199培養(yǎng)

18、基、10％胎牛血清、5％DMSO。
　　 2.3分組及CCK-8細胞活性檢測實驗
　　 將濃度為105個/ml的臍靜脈內皮細胞（第3代）置于25 cm2細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，按照1∶3傳至第4代，至對數生長期，棄去培養(yǎng)基，PBS沖洗、胰蛋白酶消化、吹打收集細胞，加入HUVECs專用培養(yǎng)基重懸，再次調整濃度為105個/ml。按照8組、每組5復孔接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100μl，編號為1，2，3，4，5，6，7，8組。另設一

19、本底組編號為0，只加100μl全培養(yǎng)基，不含臍靜脈內皮細胞，用于檢測CCK-8實驗本底值。共9組，45復孔。為減少試劑蒸發(fā)所致誤差，96孔板邊緣培養(yǎng)孔棄用并加PBS溶液填充。完畢后，將96孔板置于培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)24h，預培養(yǎng)后加入HUVECs專用培養(yǎng)基、含TNF-α濃度為2μg/ml的培養(yǎng)基，調整每孔總容量至200μl。其中，1-8組含腫瘤壞死因子濃度分別為0ng/ml,5 ng/ml,10 ng/ml,20 ng/ml,40 ng/m

20、l,60 ng/ml,80 ng/ml,100 ng/ml，0組加專用培養(yǎng)基至200μL，不含臍靜脈內皮細胞及腫瘤壞死因子。繼續(xù)培養(yǎng)(37℃，5％CO2)48小時后加入Cell Counting Kit-8(CCK-8)細胞活力檢測試劑，每孔10μl，恒溫培養(yǎng)箱中反應4小時后酶標儀下檢測450nm波長處的吸光度值（OD值）。
　　 3.統(tǒng)計學方法
　　 所有數據采用SPSS13.0軟件處理，計量數據以均數±標準差（(x)

21、±S）表示，統(tǒng)計學分析采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較采用LSD-t法，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：
　　 1.臍靜脈內皮細胞形態(tài)學觀察
　　 顯微鏡下觀察，原代臍靜脈內皮細胞呈單層生長，形態(tài)為卵圓形，邊界清楚，細胞質豐富，胞核呈橢圓形。培養(yǎng)2-3天后細胞鋪滿板底，呈梭形，邊界清楚，細胞質豐富，胞核呈橢圓形，單層排列，分布均勻，貼壁生長，呈典型鋪路石樣。
　　

22、 2.Ⅷ因子相關抗原熒光染色
　　 熒光顯微鏡下觀察，細胞質內可見棕黃色顆粒，胞核為藍色，說明細胞內有內皮細胞特有的第Ⅷ因子相關抗原存在，對照組為陰性反應。
　　 3.CCK-8細胞活性檢測結果
　　 從組1到組7，隨TNF-α濃度逐漸升高，各組細胞在450nm波長下的吸光度值(OD value)逐漸降低(P＜0.05)，從（0.721±0.0129）降至（0.548±0.0196），組間差異具有統(tǒng)計學意義。但

23、組7與組8之間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，我們認為可能與濃度梯度過小有關。
　　 結論：
　　 1.腫瘤壞死因子α(TNF-α)刺激對臍靜脈內皮細胞活性可產生明顯影響，5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、60ng/ml、80ng/ml的組間差異具有統(tǒng)計學意義，80 ng/ml、100ng/ml組間差異不具統(tǒng)計學意義。
　　 2.擬選取0 ng/ml、5 ng/ml、20 ng/ml

24、、80 ng/ml濃度分組進行下一步實驗。
　　 第二部分TNF-α對臍靜脈內皮細胞分化表達PD-L1蛋白的影響
　　 目的:采用不同濃度TNF-α持續(xù)刺激臍靜脈內皮細胞，Western Blot方法檢測各組細胞PD-L1蛋白表達。探討TNF-α對臍靜脈內皮細胞分化表達PD-L1蛋白的影響。
　　 對象和方法：
　　 1.對象體外培養(yǎng)臍靜脈內皮細胞。
　　 2.方法
　　 2.1臍靜脈內皮

25、細胞解凍培養(yǎng)。將凍存于液氮中的臍靜脈內皮細胞（3代）取出，迅速置于37℃恒溫水浴鍋中，約1-2分鐘后完全融化，將含有細胞的凍存液移至離心管中，經1000轉/分、5分鐘離心，吸去上層凍存液，加入HUVECs專用培養(yǎng)基，反復混合均勻，移入25cm2細胞培養(yǎng)瓶中。每12小時觀察細胞形態(tài)，每48小時全量換液。待細胞培養(yǎng)至對數生長期，按照1∶4傳代。
　　 2.2實驗分組及腫瘤壞死因子干預。待4代細胞培養(yǎng)至對數生長期，換液加入含有腫瘤壞死

26、因子的專用培養(yǎng)基，調整腫瘤壞死因子濃度分別為A組0ng/ml、B組5 ng/ml、C組20 ng/ml、D組80 ng/ml。恒溫培養(yǎng)箱中孵育48小時，棄去上層培養(yǎng)基，PBS反復沖洗2遍，含EDTA的胰蛋白酶消化，加入PBS溶液反復吹打細胞至脫落懸浮，離心收獲各組細胞，PBS反復離心沖洗2遍，加入裂解液提取蛋白，BCA法總蛋白定量。調整上樣量為25μg總蛋白/樣本，上樣，電泳，轉膜，封閉過夜。封閉完畢后PBST洗膜5次，加一抗，37℃反

27、應1.5h，PBS洗膜5次，加辣根過氧化物酶標記二抗，37℃反應1h，PBS洗膜5次。染色，曝光，采用BIORAD GELDOC XR凝膠成像系統(tǒng)依次顯影、定影，QuantityOne Basic軟件分析膠片中蛋白條帶。本步試驗重復3次。
　　 3.統(tǒng)計學方法
　　 所有數據均采用SPSS13.0軟件處理，計量數據以均數±標準差（(x)±S）表示，統(tǒng)計學分析多樣本比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩

28、比較采用LSD-t法，以P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：
　　 1.解凍后細胞生長狀態(tài)正常，貼壁生長，呈梭形，單層排布，呈典型鋪路石樣。細胞質豐富，胞核呈橢圓形。
　　 2.隨TNF-α濃度逐漸升高，A、B、C、D四組細胞的PD-L1蛋白表達逐漸下降(P＜0.05)，Western blot曝光顯色灰度比值分別為A組（1.797±0.1550），B組（1.512±0.1022），C組（1.108±

29、0.0799），D組（0.845±0.0542），組間差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 結論：
　　 腫瘤壞死因子α可明顯抑制臍靜脈內皮細胞分化表達PD-L1蛋白。抑制強度與TNF-α濃度正相關。
　　 第三部分 TNF-α通過p38MAPK通路調控臍靜脈內皮細胞表達PD-L1
　　 目的：以p38蛋白特異性抑制劑SB203580阻斷p38MAPK信號通路后，觀察臍靜脈內皮細胞受TNF-α刺激后PD-L1表達變

30、化，探討臍靜脈內皮細胞表達PD-L1與p38MAPK信號通路的關系。
　　 對象和方法：
　　 1.對象體外培養(yǎng)人臍靜脈內皮細胞。
　　 2.方法
　　 2.1臍靜脈內皮細胞解凍和培養(yǎng)。
　　 將凍存于液氮中的臍靜脈內皮細胞（3代）取出，迅速置于37℃恒溫水浴鍋中，約1-2分鐘后全部融化，將含有細胞的凍存液移至離心管中，經1000轉/分、5分鐘離心，棄去上層凍存液，加入HUVECs專用培養(yǎng)基，反復

31、混合均勻，種植于25cm2細胞培養(yǎng)瓶中。每12小時觀察細胞形態(tài)，每48小時全量換液。待細胞培養(yǎng)至對數生長期，按照1∶3傳至第4代。
　　 2.2實驗分組
　　 將第4代臍靜脈內皮細胞接種于6孔培養(yǎng)板中，設3組，每組2復孔。根據是否使用TNF-α和p38MAPK通路抑制劑SB203580將實驗分成三組，TNF-α濃度選擇80ng/ml，SB203580用二甲基亞砜(DMSO)溶解。
　　 第一組為正常培養(yǎng)組:使用專

32、用培養(yǎng)基孵育臍靜脈內皮細胞48小時作為空白對照;
　　 第二組為TNF-α干預組:使用專用培養(yǎng)基和配制好的含TNF-α濃度為2μg/ml的培養(yǎng)基，調整TNF-α濃度為80 ng/ml，溫箱中培養(yǎng)48小時;
　　 第三組為TNF-α和SB203580共同干預組:加入DMSO溶解的p38MAPK阻斷劑SB203580預處理1小時，然后加入含TNF-α的培養(yǎng)基，調整TNF-α濃度為80 ng/ml，置于溫箱中培養(yǎng)48小時。

33、r>　　 2.3 Western blot方法檢測PD-L1蛋白
　　 收獲各組細胞，加入裂解液提取蛋白，BCA法總蛋白定量。調整上樣量為25μg總蛋白/樣本，上樣，電泳，轉膜，封閉過夜。封閉完畢后PBST沈膜5次，加一抗，37℃反應1.5h，PBS沈膜5次，加辣根過氧化物酶標記二抗，37℃反應1h，PBS洗膜5次。染色，曝光，采用BIORAD GELDOC XR凝膠成像系統(tǒng)依次顯影、定影，QuantityOne Basic軟

34、件分析膠片中蛋白條帶。本步實驗重復3次。
　　 3.統(tǒng)計學方法
　　 所有數據采用SPSS13.0軟件處理，計量數據以均數±標準差（(x)±S）表示，統(tǒng)計學分析多樣本比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較采用LSD-t法，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：
　　 1.TNF-α干預組較正常培養(yǎng)組、TNF-α和SB203580共同干預組表達PD-L1明顯下降，依次分別

35、為（0.486±0.0571）、（1.069±0.0401）、(1.215±0.0506)，P＜0.05，組間差異具有統(tǒng)計學意義。正常培養(yǎng)組、TNF-α和SB203580共同干預組表達PD-L1差異亦有統(tǒng)計學差異，正常培養(yǎng)組低于TNF-α和SB203580共同干預組。
　　 結論：
　　 1.p38MAPK通路參與了TNF-α影響臍靜脈內皮細胞分化表達PD-L1蛋白的過程。
　　 2.正常培養(yǎng)組PD-L1蛋白表達