NGX6負調控SAPK-JNK通路抑制人結直腸癌細胞核轉錄因子和CylinD1表達的研究.pdf

1、結直腸癌(Colorectal Callcer CRC)是常見消化道惡性腫瘤。迄今，結直腸癌的確切發(fā)病機制仍不十分清楚，但目前普遍認為結直腸癌發(fā)病是一個涉及多基因、多步驟的復雜過程。NGX6基因是中南大學腫瘤研究所分子遺傳室克隆的一個侯選抑瘤基因(基因登陸號：AF188239)，前期研究發(fā)現(xiàn)NGX6在結直腸癌組織中表達明顯下降；它能夠延緩細胞周期的進程；抑制腫瘤增殖和種植瘤的生長：并能抑制腫瘤血管的生成，下調VEGF的表達；使結腸癌細胞

2、體外侵襲能力下降，同時恢復腫瘤細胞間隙；并負調控。beta-catenin/Wnt通路。且前期基因芯片研究發(fā)現(xiàn)NGX6能使MAPK(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)通路相關的兩個基因：MADD(MAP-kinase activating death domain)；Rhoc(Rash homologgene family,member C)的表達下調三倍以上，而這兩個基因主要是與ERK(P

3、42/P44MAPK)通路和SAPK/JNK通路有關。所以本課題在前期工作的基礎上，從NGX6對信號傳導的影響來探討其抑制腫瘤增殖、侵襲、轉移的分子機制。并且重點研究MAPK通路中ERK(P42/P44MAPK)通路和SAPK/JNK通路中關鍵分子P-JNK和P-ERK在結直腸癌中的表達及臨床意義，并進一步探討NGX6對ERK/MAPK通路和SAPK/JNK通路影響和對相關核轉錄因子的調控。 P-JNK和P-ERK在結直腸組織芯

4、片中的表達本文在336個點陣的結直腸組織芯片上，利用免疫組化檢測P-JNK和P-ERK．蛋白表達，并進一步分析蛋白陽性表達與結直腸組織臨床病理特征的關系。結果發(fā)現(xiàn)P-JNK和P-ERK蛋白在癌組織較粘膜的表達明顯增高。且P-JNK在結直腸癌組織的陽性表達與性別、分化程度、Duke'S分期、遠處轉移相關，P-ERK蛋白陽性表達在結直腸癌組織中與分化程度相關，在癌旁粘膜中與遠處轉移相關。然而，P-JNK和P-ERK的蛋白表達之間沒有相關性。

5、 NGX6對SPAK/JNK和ERK/MAPK通路的影響以三組結腸癌細胞株(HT-29、pcDNA3.1(+)/HT-29、pcDNA3.1(+)/NGX6/HT-29)為研究對象。采用Western Blot、免疫熒光及免疫細胞化學方法檢測NGX6對JNK、P-JNK、ERK、P-ERIC蛋白質表達和核移位的影響。結果證實：過表達NGX6基因能抑制HT-29細胞中JNK1/2的活化和核移位，使P-JNK1在胞漿聚集，入核減少：

6、但卻并不能抑制ERK1/2的活化和核移位。 NGX6對核轉錄因子AP-1(c-Jun、c-fos)、Ets-1的影響通過Western Blot檢測轉染NGX6基因后HT-29細胞的核轉錄因子AP-1(c-Jun、c-fos)、Ets-1的蛋白質表達均明顯下調；提示NGX6可以抑制MAPK通路的下游轉錄因子的表達。予以信號通路抑制劑分別抑制ERK及腫<信號通路后發(fā)現(xiàn)ERK及JNK信號通路均可調控c-Jun、Ets-1表達，但c-

7、fos主要受ERK路的調控，JNK通路只能部分抑制抑制c-fos表達。說明NGX6可能是通過SPAK/JNK通路來抑制核轉錄因子的表達。熒光素酶報告質粒檢測系統(tǒng)檢測NGX6對結腸癌SW620細胞系中Mark通路的關鍵分子AP-1的活性的影響。發(fā)現(xiàn)瞬時轉染了NGX6的SW620細胞系中AP-1的活性明顯下降。 NGX6對細胞周期調控蛋白CyclinDl的影響Western Blot檢測轉染NGX6基因對細胞周期調控蛋白Cyclin

8、D1的蛋白質表達的影響；熒光素酶報告質粒檢測系統(tǒng)檢測NGX6對結腸癌SW620細胞系中CyclinD1活性的改變。結果顯示NGX6能夠抑制CyclinD1蛋白質表達并下調CyclinD1轉錄活性。 綜上所述：本研究證實了SPAK/JNK通路和ERK/MAPK通路中關鍵分子P-JNK和P-ERK在結直腸癌中活化增強，而NGX6可以通過SPAK/JNK通路負調控結直腸癌的核轉錄因子及抑制AP-1的轉錄活性，并通過抑制具有AP-1結合