鐵超載肝損傷機理及黃芩苷干預作用的研究.pdf

1、隨著生活水平的提高，膳食中肉類比重的增加，體內鐵超載（Iron overload）的現象值得引起重視。鐵超載是指由于遺傳因素或病理條件導致機體出現一系列病理變化。近幾年來，鐵超載所帶來的負面效應，已經引起了人們越來越多的關注。鐵除了可以通過催化產生自由基而導致脂質過氧化以及蛋白質氧化外，它還可能促進活性氮的生成甚至直接催化活性氮與蛋白質反應而導致蛋白質硝化，同時它還會對體內其它一些微量元素產生影響。鐵超載病理條件下，肝中蛋白質硝化情況及

2、對其它微量元素的影響，尚未有人研究過。本文在整體動物、細胞水平和生化水平上，分別從鐵超載對微量元素的影響及促進蛋白質氧化和硝化兩個方面來研究鐵超載肝損傷病理機制，并在此基礎上探討了黃芩苷對鐵超載肝損傷的干預作用。主要內容包括以下幾個方面：
　　 1、選用成年雄性大鼠，采用兩周內5 次腹腔注射鐵右旋糖苷（每次鐵量分別為30，60，100 mg Fe/kg bw）的方法造成大鼠慢性鐵超載模型；與此同時，對總鐵劑量為500 mg Fe

3、/kg的大鼠分別喂以含0.3%和1%黃芩苷的飼料。通過紫外可見分光光度法測定一些基本生化指標、毛細管電泳檢測尿液中硝酸鹽含量、免疫沉淀及免疫組化分析肝中蛋白質硝化等，來研究鐵超載導致肝損傷的情況及黃芩苷的干預作用。結果顯示，鐵超載可以導致血清鐵、轉鐵蛋白飽和度、谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、肝中鐵含量、丙二醛（MDA）含量、尿液中硝酸鹽含量及肝中3-硝基酪氨酸含量顯著增加，而肝中總鐵結合力及巰基（SH）含量則隨給鐵劑量的增

4、加而明顯降低；補充黃芩苷后能顯著降低由鐵超載所導致大鼠血清轉鐵蛋白飽和度、ALT、AST、肝中鐵含量、MDA含量、尿液中硝酸鹽含量以及蛋白質硝化水平的增加。這表明鐵超載除引起肝臟常規(guī)指標改變外，同時還可引起蛋白質發(fā)生硝化；黃芩苷的攝入能顯著減輕鐵超載所導致的肝臟損傷。
　　 2、選用成年雄性小鼠，采用兩周內5 次腹腔注射鐵右旋糖苷（每次鐵量為100 mgFe/kg bw）的方法造成小鼠慢性鐵超載模型；同時喂以含1%黃芩苷的飼料。

5、利用HPLC-ICP-MS對肝線粒體、微粒體及上清液三種亞細胞器中微量元素（鐵、銅、鋅及鎘）的含量及分布進行檢測。結果顯示，鐵在肝中主要以高分子量蛋白形式存在，而銅、鋅及鎘在各種分子量蛋白中均含有。鐵超載可導致肝中微量元素鋅及鎘的含量顯著增加，同時對銅和鎘在肝中的分布產生影響；黃芩苷的攝入顯著降低由鐵超載所導致的鐵、鋅及鎘的含量增加。這表明，過多鐵在體內聚積將對其它微量元素的代謝產生影響；黃芩苷的攝入能顯著降低由鐵超載所導致的肝中微量元

6、素的增加。
　　 3、選用肝中重要的酶之一—谷氨酸脫氫酶（GDH）做為研究對象，采用蛋白質硝化的兩種主要途徑（ONOO-及鐵原卟啉(hemin)-H2O2-NO2-）來引起蛋白質氧化和硝化，通過紫外可見光譜、圓二色譜、凝膠電泳、免疫印跡以及液質聯用等方法來研究蛋白質氧化和硝化各自對GDH活性的影響。研究結果表明：(1)在生理pH條件下，Hemin-H2O2-NO2-和SIN-1 均可催化GDH發(fā)生蛋白氧化和硝化而使其滅活，但是蛋

7、白質氧化（非巰基氧化）對活性的作用要顯著強于蛋白質硝化；(2)Hemin-H2O2-NO2-和SIN-1 雖然都可以導致GDH發(fā)生蛋白質氧化和硝化，但兩者的作用方式卻是不盡相同的。Hemin-H2O2-NO2-催化GDH發(fā)生硝化的酪氨酸殘基是Tyr262和Tyr471，而SIN-1 催化GDH發(fā)生硝化的酪氨酸殘基則是Tyr401和Tyr493。
　　 4、采用外源性硝化體系（Hemin-H2O2-NO2-及檸檬酸鐵-H2O2-N

8、O2-）來造成HepG2細胞中氧化（硝化）應激增加，利用免疫沉淀法從其中提取谷胱甘肽硫轉移酶（GSTs），然后檢測其表達水平、蛋白氧化水平、硝化水平及酶活力情況，以此來探討鐵卟啉和檸檬酸鐵在催化H2O2-NO2-所導致蛋白質氧化和硝化上的差異，并在此基礎上探討黃芩苷的干預作用。研究結果表明：(1)鐵卟啉和檸檬酸鐵在催化H2O2-NO2-體系導致蛋白質氧化和硝化的能力上有所差異。Hemin 具有較強的催化蛋白質氧化和硝化的作用；而檸檬酸鐵