半滑舌鰨性腺差異表達(dá)基因的克隆鑒定與表達(dá)分析.pdf

1、半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)是一個(gè)優(yōu)良的高效海水養(yǎng)殖品種。但半滑舌鰨雌、雄個(gè)體差異巨大，并且雄性個(gè)體生殖能力弱，因而導(dǎo)致繁殖能力差。因此開(kāi)展性別調(diào)控，提高受精效率為主的繁殖生物學(xué)研究對(duì)于提高半滑舌鰨的養(yǎng)殖效率，增加養(yǎng)殖產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益，都有重要意義。近幾年來(lái)，有關(guān)半滑舌鰨繁殖生物學(xué)的研究已全面展開(kāi)，但僅限于組織學(xué)和胚胎學(xué)的研究，在基因水平上研究還未見(jiàn)報(bào)到，因此研究半滑舌鰨雌雄性腺的差異表達(dá)基因譜不僅對(duì)于研究造成

2、其雌、雄發(fā)育差異的機(jī)制，研究魚(yú)類性別決定和分化的過(guò)程有著重要的理論意義而且有利于探索半滑舌鰨性別調(diào)控以及提高受精效率的新方法。本文采用SSH的方法，建立了半滑舌鰨成體魚(yú)卵巢與精巢的差減cDNA文庫(kù)，通過(guò)篩選鑒定與測(cè)序獲得了41個(gè)性腺差異表達(dá)的非重復(fù)克隆，進(jìn)而通過(guò)RACE技術(shù)克隆了其中5個(gè)基因，并對(duì)其進(jìn)行了序列特征和時(shí)空表達(dá)分析。此外還通過(guò)同源克隆的方法克隆了在精巢中特異表達(dá)的DMRTI基因，并對(duì)其進(jìn)行了組織表達(dá)分析。 以成體半滑

3、舌鰨卵巢作為檢測(cè)子(tester)，成體魚(yú)的精巢作為驅(qū)趕子(driver)，分別提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA。經(jīng)兩輪差減雜交，兩輪抑制性PCR擴(kuò)增后，取差減的PCR產(chǎn)物與T載體連接，構(gòu)建抑制差減cDNA文庫(kù)，隨機(jī)挑取2000余個(gè)克隆，對(duì)其中1000多個(gè)克隆進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，發(fā)現(xiàn)近600個(gè)克隆中均含有插入片段，大小在250-2000bp之間，進(jìn)一步對(duì)含有插入片段的近600個(gè)克隆進(jìn)行了斑點(diǎn)雜交篩選，得到196個(gè)性腺差異表達(dá)的陽(yáng)性克

4、隆，經(jīng)測(cè)序共獲得166陽(yáng)性克隆的結(jié)果，共41個(gè)非重復(fù)的克隆，其中已知基因20個(gè)未知基因21個(gè)。 利用RACE技術(shù)成功克隆到了半滑舌鰨的zp3α、Aquaporinlo、survivin、PABP和RacGAP1這5個(gè)與生殖相關(guān)的基因，這些基因在半滑舌鰨中都是首次被克隆鑒別。ZP3蛋白是卵膜的組成成分之一，其在卵子形成和受精中起到重要作用。在差減文庫(kù)中篩選并克隆了—ZP3亞家族的成員，命名為zp3α，該亞家族中的另外一成員在本實(shí)驗(yàn)

5、構(gòu)建的全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)中獲得，命名為zp3b。兩者的cDNA全長(zhǎng)分別為1638bp和1135bp，開(kāi)放閱讀框分別編碼518和312個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析均表明兩者屬于ZP3亞家族。RT-PCR分析表明，二者在卵巢中大量表達(dá)，同時(shí)也在其它一些雌性的組織中有低量表達(dá)，有意思的是zp3bmRNA也在精巢和雄性的腎臟中被檢測(cè)到。Aquaporinlo主要在卵巢中表達(dá)，與海水魚(yú)類卵子成熟吸水排卵有關(guān)。在差減cDNA文庫(kù)中克隆了半

6、滑舌鰨的Aquaporinlo基因，同時(shí)通過(guò)同源克隆的方法克隆了非卵巢特異表達(dá)的Aquaporinl基因，二者的cDNA全長(zhǎng)分別為993bp和1335bp，開(kāi)放閱讀框分別編碼262和261個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。RT-PCR分析表明Aquaporinlo僅在卵巢中大量表達(dá)在雌性的腎臟中微量表達(dá)，Aquaporinl在雌性和雄性的多種組織中均有表達(dá)。Survivin是一種細(xì)胞凋亡抑制因子，其在卵子形成和胚胎發(fā)育中具有重要作用。克隆了半滑舌鰨的s

7、urvivin基因，序列分析表明該基因cDNA全長(zhǎng)704bp，開(kāi)放閱讀框編碼147個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，該蛋白包含一個(gè)BIR結(jié)構(gòu)域。RT-PCR分析表明該基因主要在卵巢中表達(dá)，隨著胚胎發(fā)育表達(dá)逐漸減少，這可能表明該基因在半滑舌鰨卵子形成和早期胚胎發(fā)育中起到重要作用。ePABP是特異的在卵巢和早期胚胎表達(dá)的Poly(A)結(jié)合蛋白。從差減文庫(kù)中克隆了-PABP因，序列分析及RT-PCR分析組織及胚胎發(fā)育時(shí)期的表達(dá)，初步認(rèn)為該基因可能為與其它物種

8、的ePABP2因同源。RacGAP1是小G蛋白R(shí)ac重要的調(diào)控因子，在調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架，細(xì)胞移動(dòng)，細(xì)胞周期調(diào)控以及細(xì)胞凋亡方面起重要作用。從差減文庫(kù)中克隆了一主要在卵巢中表達(dá)的RacGAP1基因，這是第一次發(fā)現(xiàn)主要在卵巢中表達(dá)的RacGAP1基因，組織表達(dá)及胚胎發(fā)育的表達(dá)分析，可能暗示該基因在卵子形成和胚胎發(fā)育中起重要作用。 利用同源克隆的方法克隆了半滑舌鰨的DMRT1基因，該基因cDNA序列全長(zhǎng)1232bp，編碼258個(gè)氨基酸的蛋