PDTC對暴發(fā)性肝衰竭大鼠肝組織NF-κB表達和細胞凋亡的影響.pdf

1、目的：暴發(fā)性肝衰竭（fulminant hepatic failure，F(xiàn)HF）是一種病死率極高的臨床綜合征，目前除肝移植外尚無特效的治療措施，而肝源短缺、費用昂貴、術后長期應用免疫抑制劑限制了其在臨床的實施，因此，尋找有效的臨床內科治療方法十分必要。然而發(fā)病機制的明確是創(chuàng)新科學、有效的治療措施的基礎。近年來，有關暴發(fā)性肝衰竭的研究取得了諸多進展，但是其具體機制尚不十分清楚。
　　 有學者提出炎癥因子網絡的激活在FHF的發(fā)生中起

2、著重要作用，尤其是對位于炎癥網絡中心地位的核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的研究，成為最近十年的熱點。研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB可以通過啟動轉錄多種炎癥因子的表達促進炎癥進展，如誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthesis，iNOS）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）等。暴發(fā)性肝衰竭的病理研究認為除了肝細胞壞死，大量肝細胞凋亡參與了其病理過程

3、。NF-κB能啟動轉錄很多下游基因的表達，這些基因表達的產物不但參與了炎癥反應的發(fā)生，而且在細胞凋亡中發(fā)揮著重要作用。NF-κB調控著一系列凋亡誘導和凋亡抑制基因的表達，包括凋亡蛋白酶（caspase）、死亡受體、凋亡抑制蛋白家族部分成員、Bcl-2蛋白家族部分成員以及某些原癌基因。但是由于刺激NF-κB活化的因素不同，活化的靶基因不同，NF-κB在調控細胞凋亡方面也發(fā)揮著不同的作用，通過信號轉導途徑既可抑制肝細胞的凋亡亦可促進肝細胞的

4、調亡。目前國內外對NF-κB在暴發(fā)性肝衰竭中肝細胞凋亡的作用研究較少。因此NF-κB在暴發(fā)性肝衰竭肝細胞凋亡中的作用及其機制尚不清楚。
　　 本研究采用Wistar大鼠腹腔注射D氨基半乳糖（D-galactosamine，D-GalN）后皮內注射脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）制造暴發(fā)性肝衰竭動物模型，并將應用NF-κB特異性抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸（pyrrolidine dithiocarbamate

5、，PDTC）預處理的大鼠與模型組大鼠進行比較。通過采用常規(guī)蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色、流式細胞學技術（flow cytometry，F(xiàn)CM）、脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）判斷比較抑制NF-κB表達前后肝組織細胞凋亡的情況，了解PDTC在

6、暴發(fā)性肝衰竭中對NF-κB表達及肝細胞凋亡的影響，初步探討NF-κB在暴發(fā)性肝衰竭肝細胞凋亡中的作用。應用免疫組化及反轉錄多聚酶鏈反應（reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR）方法，從蛋白、基因水平檢測c-myc、survivin表達，探討NF-κB是否通過調節(jié)凋亡相關基因c-myc、survivin的表達參與暴發(fā)性肝衰竭的發(fā)病。為臨床如何應用NF-κB抑制劑治療肝衰

7、竭提供理論依據。
　　 方法：1、研究對象：雄性Wistar大鼠60只，清潔級，體重180-200g。大鼠禁食24小時后，隨機分為2組，即模型組和PDTC組，每組30只。模型組應用D-GalN800mg/kg+LPS10ug/kg制造暴發(fā)性肝衰竭模型；PDTC組應用PDTC100mg/kg預處理，余同模型組。2、標本采集和保存：從PDTC組、模型組各取6只分別于給D-GalN+LPS后2、4、8、12、24小時行股靜脈放血處死，

8、迅速小心剖出肝臟，取適量肝組織分別固定于10％中性甲醛液、70％乙醇中，部分肝組織液氮冰凍后存放于-80℃冰箱；將全血放置30min，離心取上層血清行生化學檢測。3、HE染色光鏡下觀察肝組織病理學變化。4、采用Olympus AU2700全自動生化分析儀對兩組大鼠血清進行肝功能檢測丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）及總膽紅素（total bilirubin，TB）。5、采用免疫組織化學S-P法對

9、肝組織標本進行NF-κBp65、c-Myc、survivin蛋白染色。6、采用RT-PCR方法對NF-κB、c-myc、survivin mRNA進行半定量分析。7、應用流式細胞學技術測定70％乙醇固定的兩組肝組織細胞凋亡率（apoptotic rate，AR），進行分析比較。8、TUNEL法檢測兩組肝組織原位肝細胞凋亡情況，凋亡指數（apoptotic index，AI）=凋亡細胞數/總細胞數×100％。9、統(tǒng)計學處理：應用spss1

10、1.5統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，采用秩和檢驗和Spearman秩相關分析對數據進行統(tǒng)計。
　　 結果：
　　 1、一般狀況觀察：模型組大鼠隨著給藥時間的延長出現(xiàn)活動減少、反應遲鈍、毛發(fā)豎立、嗜睡、昏迷等情況；PDTC組大鼠一般狀況好于模型組，給藥后24小時只有毛發(fā)豎立、活動少等表現(xiàn)，無嗜睡、昏迷等肝性腦病表現(xiàn)。
　　 2、肝組織形態(tài)學觀察：（1）大體標本觀察：模型組大鼠肝臟隨著給藥時間的延長出血點及淤血斑均逐漸增多

11、，到24小時肝組織呈暗紅色，大片出血，淤血嚴重；PDTC組隨著給藥時間的延長，只有出血點增多，至24小時仍未見大片出血、淤血現(xiàn)象。（2）HE染色：模型組大鼠肝組織病理顯示給藥后2小時肝小葉完整，肝索排列規(guī)則；4小時可見肝細胞嗜酸性變及凋亡小體，少量炎細胞浸潤；8小時可見灶狀壞死，伴炎細胞浸潤，可見多量凋亡小體；12小時肝細胞片狀壞死，可見炎細胞浸潤，可見凋亡肝細胞；24小時肝組織大片壞死，出血嚴重，殘留散在肝細胞及凋亡小體；PDTC組大

12、鼠肝細胞壞死、凋亡較模型組均明顯減輕。
　　 3、生化檢測結果：模型組大鼠血清ALT及TB水平隨著給藥時間的延長呈現(xiàn)上升趨勢，12、24小時急劇升高；PDTC組大鼠血清ALT、TB較模型組降低，各時間點兩組之間p值分別為（ALT：0.025、0.037、0.631、0.004、0.004；TB：0.747、0.045、0.872、0.004、0.004）。
　　 4、細胞凋亡的變化：流式細胞學技術檢測細胞凋亡率及TUNE

13、L法計算凋亡指數結果均顯示模型組呈現(xiàn)上升趨勢（p<0.05）；PDTC組較模型組細胞凋亡減少（p<0.05）。
　　 5、NF-κB的表達變化：模型組大鼠肝組織隨著給藥時間的延長，在基因及蛋白水平表達均呈現(xiàn)上升趨勢（p<0.05）；PDTC組較模型組下降（p<0.05）。
　　 6、c-myc、survivin表達變化：模型組肝組織c-myc、survivin mRNA表達在4、24呈現(xiàn)雙峰，PDTC組肝組織surviv

14、in。mRNA表達較模型組無明顯下降（p>0.05），c-mycmRNA在4、8、24小時較模型組表達下降（p<0.05），2、24小時無明顯下降（p>0.05）；模型組肝組織c-Myc蛋白表達在4、24小時呈現(xiàn)雙峰，Survivin呈現(xiàn)上升趨勢，PDTC組肝組織表達較模型組無明顯下降（p>0.05）。
　　 7、Survivin、c-myc表達與細胞凋亡率相關性分析：survivin、c-myc表達與細胞凋亡率呈負相關（r=-

15、0.491、-0.414，p=0.000、0.004）。
　　 結論：
　　 1、利用D-GalN聯(lián)合LPS制造暴發(fā)性肝衰竭大鼠模型，從形態(tài)學、細胞學以及基因水平證實了肝細胞凋亡在暴發(fā)性肝衰竭病理過程中起著重要作用。
　　 2、從細胞、蛋白和基因水平證實NF-κB在D-GalN+LPS所致實驗性暴發(fā)性肝衰竭發(fā)病中除了促炎作用，還能誘導肝細胞凋亡。
　　 3、從蛋白和基因水平證實了在D-GalN+LPS所致

16、實驗性暴發(fā)性肝衰竭中抗氧化劑PDTC能有效抑制NF-κB的表達。
　　 4、PDTC能通過抑制NF-κB活性，減輕D-GalN+LPS所致暴發(fā)性肝衰竭大鼠肝細胞凋亡，改善病情，為臨床應用NF-κB抑制劑治療肝衰竭提供了理論依據。
　　 5、c-Myc、survivin在D-GalN+LPS所致實驗性暴發(fā)性肝衰竭中具有抑制肝細胞凋亡的作用，但NF-κB對其無明確的調控作用，提示NF-κB調控肝細胞凋亡的機制復雜，尚需進一步