乙酰肝素酶調(diào)節(jié)胃癌細胞功能及其基因表達譜變化研究.pdf

1、目的：
　　 探討乙酰肝素酶（heparanase，HPSE）基因?qū)ξ赴┘毎飳W行為的影響；闡明HPSE基因在胃癌細胞信號轉(zhuǎn)導、生長發(fā)育、炎癥反應及腫瘤轉(zhuǎn)移等多項生物過程中的可能分子機制
　　 方法
　　 1、siRNA對胃癌細胞乙酰肝素酶基因表達及其生物學行為的影響
　　 ①應用RT-PCR技術(shù)篩選HPSE基因高表達的胃癌細胞株。②設計、合成反義寡脫氧核苷酸（AS-ODN）及對照寡脫氧核苷酸（NS-O

2、DN），轉(zhuǎn)染高表達HPSE基因的胃癌細胞株，利用Real-Time PCR技術(shù)確定沉默效果最佳的siRNA濃度，并運用Real-Time PCR和Western Blot技術(shù)分別在mRNA和蛋白水平驗證對HPSE基因表達的沉默效果。③應用透射電鏡觀察HPSE siRNA對胃癌細胞SGC-7901形態(tài)學的影響；采用Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術(shù)檢測HPSE siRNA對胃癌細胞SGC-7901凋亡的影響。④應用Matri

3、gel侵襲實驗和細胞遷移實驗研究HPSE siRNA對胃癌細胞SGC-7901侵襲力和遷移能力的影響。
　　 2、乙酰肝素酶反義寡核苷酸對胃癌細胞基因表達譜的影響
　　 應用Affymetrix Human U133 Plus2基因芯片技術(shù)，分別提取siRNA抑制HPSE基因表達前后胃癌細胞SGC-7901的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進一步熒光標記后進行芯片雜交，雜交結(jié)果經(jīng)掃描及軟件分析，最后Ratio值為Cy3/Cy

4、5（即實驗組/對照組）。差異基因篩選標準為正標Rmio（Cy3/Cy5）≥2，同時反標Ratio（Cy3/Cy5）≤0.5。分析siRNA抑制HPSE基因表達后，胃癌細胞中受HPSE調(diào)控的下游基因表達譜的變化，并且部分上調(diào)及下調(diào)基因的表達水平用Real-Time PCR進行了驗證。對于差異表達在2倍以上的基因，我們利用博奧公司的MAS3.0分析軟件進行了GO分析，并對差異表達在1.5倍以上的基因進行了Pathway分析。
　　

5、結(jié)果
　　 1、siRNA對胃癌細胞乙酰肝素酶基因表達及其生物學行為的影響
　　 ①RT-PCR技術(shù)檢測胃癌細胞株中HPSE基因表達情況，結(jié)果顯示SGC-7901細胞表達HPSE最高，故選用SGC-7901細胞為實驗細胞模型。②RT-PCR技術(shù)及Real-Time PCR實驗證實沉默效果最好的siRNA濃度為10 nM。⑦Real-Time PCR及Western Blot檢測：相對于陰性對照NC組（無義siRNA對照組

6、），siRNA沉默組的HPSE基因的mRNA水平和蛋白表達量顯著降低。④siRNA沉默HPSE基因后，透射電鏡結(jié)果顯示胃癌細胞SGC-7901形態(tài)學發(fā)生典型的凋亡現(xiàn)象；Annexin V-FITC/PI雙柒流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)凋亡細胞明顯增多，由正常細胞的1.58％升高為8.45％。⑤Transwell細胞侵襲實驗結(jié)果顯示，siRNA沉默HPSE基因后的胃癌細胞SGC-7901侵襲到Transwell膜后面的細胞數(shù)較陰性對照組顯著減少（P

7、<0.01），表明HPSE基因沉默明顯降低胃癌細胞的侵襲能力。利用細胞劃痕實驗檢測細胞的遷移能力，結(jié)果顯示，HPSE基因沉默的胃癌細胞在劃痕后24h、36h的寬度明顯大于對照組（P<0.05），表明抑制HPSE基因可明顯降低胃癌細胞的遷移能力。
　　 2、乙酰肝素酶反義寡核苷酸對胃癌細胞基因表達譜的影響
　　 Affymetrix芯片結(jié)果表明，siRNA沉默HPSE基因后，胃癌細胞SGC7901中VEGF信號通路的中心介

8、導分子PRKCA和PRKCB的表達明顯下降；介導VEGFR-2通路的錨定蛋白SHB、VEGFR-2的相互作用蛋白VE-cadherin、炎癥因子IL-1a/IL-1b表達下降，介導天然免疫的分子DEFB1、黏附分子CD44表達升高。
　　 結(jié)論
　　 1、siRNA沉默HPSE基因后，降低胃癌細胞SGC-7901的侵襲和遷移能力；
　　 2、siRNA沉默HPSE基因表達后，胃癌細胞SGC-7901中VEGF信號

9、通路的中心介導分子PRKCA和PRKCB的及傳遞該通路信號的重要分子SHB和VE-cadherin表達均下降，但跨膜糖蛋白CD44表達升高，這些分子改變可能共同參與了HPSE干涉后的血管生成抑制過程。
　　 3、siRNA沉默HPSE基因后，SHB、VE-cadherin表達下降，CD44表達升高，F(xiàn)AK通路受到抑制，這些因素可能共同作用導致胃癌細胞SGC-7901的凋亡增加。
　　 4、siRNA沉默HPSE基因后，炎