hTERT啟動子調(diào)控PTEN基因在肝細胞癌中的靶向抑癌作用.pdf

1、第一部分:PTEN與hTERT在肝細胞癌中的表達意義及其相關性研究 目的：研究肝細胞癌組織中PTEN與hTERT的表達意義，探討兩者在肝細胞癌中表達的相關性。 方法：應用免疫組化(SP法)和半定量逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)分析58例肝細胞癌及對應癌旁組織、8例正常肝臟組織中PTEN蛋白及PTENmRNA、hTERT蛋白及hTERTmRNA的表達情況，并探討二者表達的相關性。 結果：PTEN蛋白明確定位于肝

2、細胞胞漿內(nèi)。PTENmRNA和PTEN蛋白在肝細胞癌中的陽性率分別為41.38％(24/58)、44.83％(26/58)，明顯低于癌旁肝組織的陽性率100％(58/58)和正常肝臟組織中的陽性率100％(8/8)，差異具有非常顯著性(p＜0.01)。hTERT蛋白主要表達于肝細胞胞漿內(nèi)，偶見核內(nèi)表達。hTERTmRNA和hTERT蛋白在肝細胞癌中的陽性率分別為82.76％(48/58)和87.93％(51/58)，明顯高于癌旁組織中的

3、陽性率24.14％(14/58)、27.59％(16/58)，差異具有非常顯著性(p＜0.01)，8例正常肝臟組織中hTERTmRNA和hTERT蛋白均為陰性。相關分析顯示，PTEN與hTERT在肝細胞癌中的表達呈負相關(p＜0.05)。 結論：PTEN、hTERT在肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，有可能成為肝細胞癌的重要分子生物學檢測指標，且兩者表達呈負相關，提示PTEN可能在肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展過程中對hTERT的活化起著調(diào)控

4、作用。 第二部分:重組真核表達載體phTERT-PTEN的構建 目的：用分子生物學方法構建人端粒酶逆轉錄酶(hTERT)啟動子調(diào)控的抑癌基因PTEN真核表達載體，用于轉染端粒酶陽性的人肝癌細胞HepG2，以便研究肝細胞癌的靶向基因治療。 方法：分別對含hTERT啟動子的熒光素酶報告質(zhì)粒pBTdel-279和攜帶人PTEN基因的表達載體pBP-PTEN進行核酸內(nèi)切酶酶切反應，鑒定并連接酶切片段，轉化、篩選并鑒定重組

5、載體phTERT-PTEN。 結果：重組載體phTERT-PTEN經(jīng)雙酶切得到1.2kb基因片段，其序列與人PTEN基因序列完全一致。 結論：成功構建了hTERT啟動子調(diào)控的抑癌基因PTEN真核表達載體phTERT-PTEN。 第三部分:phTERT-PTEN重組載體轉染及其靶向表達效果的實驗研究 目的：檢測重組載體phTERT-PTEN在端粒酶陽性HepG2細胞中的靶向表達效果。 方法：將上述實

6、驗中構建的hTERT啟動子調(diào)控PTEN基因的重組載體phTERT-PTEN以脂質(zhì)體介導方法分別轉染端粒酶陽性的HepG2細胞和端粒酶陰性的人胚肺成纖維細胞株HELF，G418篩選得到穩(wěn)定表達的細胞株，以免疫熒光細胞化學、RT-PCR和westernblot鑒定重組載體phTERT-PTEN的表達情況。 結果：重組載體phTERT-PTEN在端粒酶陽性HepG2細胞中顯著表達，在端粒酶陰性的人胚肺成纖維細胞株HELF則無表達。

7、 結論：hTERT啟動子在端粒酶陽性HepG2細胞中能明顯激活phTERT-PTEN重組載體表達PTEN，實現(xiàn)了抑癌基因PTEN在人肝癌細胞HepG2中的靶向表達效果。 第四部分:重組體phTERT-PTEN在肝癌細胞中的靶向抑癌作用 目的：研究hTERT啟動子調(diào)控PTEN基因?qū)θ烁伟┘毎礖epG2細胞惡性表型及凋亡的影響。 方法：將前述實驗中所構建的真核表達載體phTERT-PTEN及空質(zhì)粒pBP通過脂質(zhì)

8、體介導的基因轉染方法，轉入HepG2細胞系中，G418篩選獲得穩(wěn)定表達PTEN基因的轉染細胞。通過平板克隆形成試驗、DNA凝膠電泳、流式細胞術、RT-PCR、westernblot、激光共聚焦顯微鏡和透射電鏡，觀察PTEN基因?qū)θ烁伟┘毎礖epG2惡性生物學行為及凋亡的影響。 結果：轉染后的細胞，經(jīng)免疫組織化學、RT-PCR和westernblot檢測證實有PTENmRNA及其蛋白的表達；平板克隆形成試驗證實，轉染PTEN基因

9、后，細胞形成克隆的能力降低；轉染PTEN的細胞在共聚焦顯微鏡和電鏡下可出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學改變；DNA瓊脂糖凝膠電泳呈現(xiàn)明顯的細胞凋亡梯狀條帶；流式細胞術顯示PTEN過表達改變細胞周期分布，G0/G1期細胞增加13.61％，S期細胞下降21.59％，RT-PCR、westernblot結果表明，轉染重組載體phTERT-PTEN后HepG2過表達PTEN基因并下調(diào)hTERT的表達。結論：hTERT啟動子在端粒酶陽性肝癌細胞HepG2中能