硼替佐米聯(lián)合吡柔比星體外誘導T細胞淋巴瘤-白血病細胞凋亡的實驗研究.pdf

1、 目的：T 細胞淋巴瘤(T Cell Lymphoma,TCL)是一種來源于T 淋巴細胞的惡性腫瘤性疾病,其臨床多表現(xiàn)為侵襲性或高度侵襲性,病程進展快,生存期短,對一般的抗腫瘤藥物治療反應不佳,預后較差,因此需要尋找對其更有效的治療措施,但至今仍無實質(zhì)性進展。蛋白酶體抑制劑硼替佐米(Bortezomib)通過影響細胞內(nèi)調(diào)節(jié)蛋白的降解,控制NF-кB活性,從而抑制與細胞增殖相關的基因表達,導致腫瘤細胞凋亡。吡柔比星(Pirarubici

2、n)可通過進入細胞內(nèi)迅速嵌入 DNA 核酸堿基對間,干擾轉錄過程,干擾mRNA合成,通過影響DNA聚合酶活性阻止DNA的合成等途徑抑制腫瘤細胞生長。體外實驗及多中心臨床研究均證實硼替佐米(BTZ)、吡柔比星(THP)對多種實體腫瘤具有誘導凋亡的作用,但硼替佐米對T細胞淋巴瘤是否存在誘導凋亡作用及其機制尚未完全清楚,且硼替佐米與吡柔比星是否存在協(xié)同作用尚待進一步研究。本研究將探討硼替佐米在淋巴瘤細胞株Jurkat細胞及原代T細胞白血病細胞

3、中的誘導凋亡作用,同時觀察硼替佐米聯(lián)合吡柔比星的協(xié)同作用,為T細胞淋巴瘤/白血病的臨床治療提供實驗依據(jù)。方法：1、細胞培養(yǎng)及分組：體外培養(yǎng)Jurkat細胞株,以及分離原代T淋巴細胞白血病細胞進行培養(yǎng),用不同濃度梯度的BTZ、THP單用及聯(lián)合應用對細胞進行凋亡刺激24h和48h。2、采用細胞計數(shù)試劑盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8)比色法檢測細胞增殖抑制率,倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)改變,流式細胞技術(flow cyto

4、metry,FCM)檢測細胞凋亡情況,免疫熒光技術(Immunofluorescence)分析細胞凋亡情況,觀察分析兩藥聯(lián)合是否存在協(xié)同效應。3、統(tǒng)計學分析：應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析處理數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(xˉ±s)表示,各組間采用單因素方差分析,兩兩比較采用t檢驗,檢驗水準α=0.05,P<0.05表示有統(tǒng)計學意義。結果：1、倒置相差顯微鏡下觀察可見,經(jīng)藥物刺激后的細胞形態(tài)發(fā)生了明顯的改變,細胞變暗無光澤,細

5、胞膜不完整,細胞體積縮小,細胞核碎裂等,隨藥物濃度或作用時間的增加細胞凋亡程度越大。2、細胞計數(shù)試劑盒方法檢測細胞受抑制程度結果顯示：①BTZ、THP單藥對Jurkat細胞和原代T白血病細胞增殖具有明顯的抑制作用,且抑制率呈時間和濃度依賴性。②當用不同濃度的硼替佐米聯(lián)合小劑量吡柔比星對Jurkat細胞進行干預24h時,和硼替佐米單藥組相比,各濃度的硼替佐米聯(lián)合吡柔比星對細胞抑制率明顯升高,表明BTZ和THP聯(lián)用存在良好的協(xié)同作用；作用于

6、原代T細胞白血病細胞時,BTZ和THP聯(lián)合應用同樣出現(xiàn)顯著的協(xié)同效應。③但BTZ單用及聯(lián)合THP對Jurkat細胞和原代T白血病細胞作用效果比較無明顯統(tǒng)計學差異。3、流式細胞儀檢測藥物對細胞的誘導凋亡作用結果顯示：①不同濃度的硼替佐米處理Jurkat細胞和原代T細胞白血病細胞24h后與正常對照組相比,隨著濃度的增加,凋亡率明顯增加。②而當用不同濃度的硼替佐米聯(lián)合吡柔比星對細胞進行誘導凋亡時,流式結果顯示兩藥聯(lián)合應用促細胞凋亡效率高于硼替

7、佐米、吡柔比星單藥使用組(P<0.01)。③但BTZ誘導Jurkat細胞和原代T白血病細胞的凋亡率比較無明顯差異。4、免疫熒光技術結果顯示：Jurkat細胞和原代T白血病細胞經(jīng)藥物作用后,細胞發(fā)生凋亡而導致細胞膜不完整,碘化丙啶透過缺損的胞膜而使胞核著色,且隨著藥物濃度的增大,這種細胞核被染成紅色的現(xiàn)象越明顯,提示凋亡的細胞越多。結論：1、硼替佐米可以誘導人T細胞白血病細胞株Jurkat細胞和原代T細胞白血病細胞凋亡,并且誘導細胞凋亡率