TSA和SAHA對阿爾巴斯白絨山羊脂肪間充質干細胞向脂肪細胞和神經細胞分化的影響.pdf

1、目前，體細胞核移植技術(somatic cell nuclear transfer, SCNT)在轉基因動物制備、瀕危珍稀動物保護等方面發(fā)揮著重要作用。然而，該技術中，作為核供體的體細胞具有較高分化程度，使得其不能完全被卵母細胞重編程，進而導致克隆胚胎存在死亡率高、發(fā)育率低等問題。研究表明，克隆胚胎表觀遺傳重編程的異常，是導致核移植技術生產效率低的重要原因。因此，研究人員逐漸傾向于利用分化程度更低的多能性干細胞作為克隆技術的供體細胞。然

2、而，目前家畜胚胎干細胞的體外培養(yǎng)還沒有獲得成功，因此還無法應用于轉基因家畜的制備。因此，間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)作為一類成體干細胞，具有較低的分化程度和多向分化的潛能，且易于體外培養(yǎng)，在家畜轉基因研究領域越來越受到關注。
　　脂肪組織來源的間充質干細胞以其來源豐富、易于培養(yǎng)以及具有多向分化潛能等優(yōu)點，在轉基因動物生產、細胞治療及組織工程中具有廣泛的應用前景。已有報道顯示，脂肪間充質干細

3、胞(Adipose-Derived Stem Cells，ADSCs)作為供體細胞進行核移植，可以有效提高克隆胚胎的發(fā)育率。本研究以阿爾巴斯白絨山羊脂肪間充質干細胞(goat Adipose-Derived Stem Cells，gADSCs)為研究對象，探討曲古菌素A(Trichostatin A，TSA)和伏立諾他(Vorinostat，SAHA)兩種組蛋白去乙酰化酶抑制劑(Histone deacetylase inhibitor

4、, HDACi)對其組蛋白乙酰化修飾、多能性及分化的調控機制，為進一步將該細胞應用于高效生產克隆和轉基因絨山羊等相關研究提供理論基礎。
　　一、TSA和SAHA處理對gADSCs組蛋白H3K9乙?；饔?br>　　1、gADSCs生長曲線的繪制
　　根據連續(xù)7天細胞計數，繪制生長曲線發(fā)現gADSCs的生長符合細胞生長的“S”規(guī)律，生長速度較快，生長狀態(tài)良好。
　　2、TSA和SAHA處理對gADSCs增殖活性的影響

5、r>　　分別用500nM TSA和16μM SAHA處理gADSCs24h、48h和72h，利用MTT法分析對照組、TSA與SAHA處理組的細胞活性，結果發(fā)現TSA與SAHA處理24h細胞增殖活性最高，隨處理時間延長細胞增殖活性逐漸下降。
　　3、免疫熒光和Western blot檢測gADSCs組蛋白H3K9乙?；阶兓?br>　　500nM TSA和16μM SAHA分別處理gADSCs24h。免疫熒光結果顯示，細胞中組蛋白

6、H3K9乙?；療晒庑盘枏姸蕊@著高于未處理的對照組。Western blot檢測結果顯示，組蛋白H3K9乙?；斤@著升高，且TSA比SAHA的作用效果更加明顯(P＜0.01)。結果表明，TSA和SAHA處理，能使組蛋白H3K9高度乙酰化。
　　4、Q-PCR和Western blot檢測gADSCs中HDACs表達情況
　　Q-PCR檢測HDACs轉錄水平顯示，與未處理的對照組細胞相比，500nMTSA和16μM SAHA分

7、別處理gADSCs24h，HDAC1和HDAC6的轉錄水平升高;TSA使gADSCs中SIRT1的轉錄升高，而SAHA卻使其轉錄下降。Westernblot檢測gADSCs中HDACs表達情況，TSA和SAHA使HDAC1和HDAC6的表達顯著提高，SIRT1的表達水平顯著下降(P＜0.01)。
　　二、TSA和SAHA上調組蛋白H3K9乙酰化水平對gADSCs增殖、凋亡和多能性相關基因表達的影響
　　1、TSA和SAHA處

8、理引起gADSCs細胞周期停滯和凋亡
　　流式細胞儀檢測500nM TSA和16μM SAHA分別處理gADSCs24h的細胞周期分布與凋亡情況，發(fā)現TSA和SAHA處理阻斷gADSCs細胞周期，使細胞停滯在G0/G1期，并且顯著發(fā)生早期凋亡。
　　2、Q-PCR檢測TSA和SAHA處理后gADSCs增殖、凋亡和多能性相關基因的轉錄水平變化
　　Q-PCR檢測發(fā)現，處理后的細胞中NANOG、OCT4、SOX2多能性基因

9、轉錄水平顯著升高。增殖相關基因TERT轉錄水平升高，PCNA轉錄水平降低。而凋亡相關基因P53和BAX的轉錄均顯著降低。
　　3、Western blot檢測TSA和SAHA處理后gADSCs增殖、凋亡和多能性相關基因的蛋白水平變化
　　Western blot檢測結果顯示，處理后的細胞中NANOG、OCT4多能性基因在蛋白質水平表達量升高，SOX2表達降低。而增殖相關基因TERT和PCNA，凋亡相關基因P53均顯著降低，B

10、AX顯著升高。
　　三、TSA和SAHA上調組蛋白H3K9乙酰化水平對gADSCs向脂肪細胞和神經細胞分化的影響
　　1、TSA和SAHA處理對于gADSCs向脂肪細胞誘導分化的影響
　　通過體外脂肪細胞誘導發(fā)現，對照組細胞正常分化為脂肪細胞，表明分化體系健全。在脂肪細胞分化過程中，TSA和SAHA處理可以提高脂肪細胞分化相關基因的表達，其中脂肪細胞分化關鍵轉錄因子過氧化物酶體增殖物激活受體γ2(PPARG2)顯著升高

11、。通過油紅O染色與脂滴定量顯示，TSA和SAHA促進脂肪細胞分化。
　　2、TSA和SAHA處理對于gADSCs向神經分化的影響
　　免疫熒光法檢測對照組細胞正常分化為神經細胞，表明神經分化體系可靠。在體外神經細胞誘導研究過程中，TSA和SAHA促進神經分化關鍵基因ENO2和NeuN的轉錄。
　　綜上所述，本研究使用TSA和SAHA處理阿爾巴斯白絨山羊脂肪間充質干細胞降低了組蛋白去乙?；傅幕钚裕偈菇M蛋白H3K9乙酰