ERp29基因在腸上皮細胞輻射損傷修復中的作用研究.pdf

1、腸上皮是實現(xiàn)腸道消化、免疫、內分泌等功能的主要組織細胞，也是構筑腸粘膜屏障的主要成分，在維持機體生命活動中居重要的地位。電離輻射對小腸上皮細胞具有毒副作用，一旦遭受損害會引起腸上皮生理功能障礙、機械屏障作用減弱、腸源性感染嚴重，還可繼發(fā)多器官功能不全綜合癥甚至引起死亡。研究表明：電離輻射可以誘導多種組織、細胞的基因及蛋白表達增強，也可以使另一些基因和蛋白受到抑制，這些基因和蛋白參與了輻射損傷及隨后的修復反應。若能尋找內源性有效的輻射損傷

2、修復基因，就可以顯著減少正常細胞的輻射損傷。 本課題是在國家自然科學基金資助下，重點研究電離輻射后ERp29在小腸上皮細胞中的作用及機制。課題組前期采用mRNA差異顯示技術證實了電離輻射前后基因表達存在差異，篩選并克隆到幾個輻射誘導表達基因的EST片斷。在此基礎上，我們采用雙向電泳技術，比較研究小鼠全身照射前后小腸上皮細胞蛋白質表達質譜的差異，結果發(fā)現(xiàn)ERp29在電離輻射后表達顯著升高；同時，我們以大鼠空腸上皮細胞株IEC-6作

3、為離體模型，也發(fā)現(xiàn)ERp29在電離輻射后表達顯著增加；進一步研究發(fā)現(xiàn)：IEC-6細胞中ERp29mRNA的表達在電離輻射后隨時間增加而增加。進行文獻檢索，ERp29作為內質網(wǎng)應激相關蛋白，其功能研究主要定位于參與內質網(wǎng)蛋白質折疊與運輸?shù)姆肿影閭H，但未見有關ERp29在電離輻射中作用的研究報道，我們推測：在電離輻射引起的內質網(wǎng)應激反應中，ERp29基因是一個輻射損傷的修復基因。因此，有必要研究電離輻射中該分子表達升高的原因、是否對電離輻射

4、具有保護作用及其在電離輻射中的作用機制。 對于基因功能的研究，一般多采用基因敲除(knockout)或基因表達降低(knockdown)等方法，RNA干擾作為抑制特異基因表達的重要手段，可以簡單、有效、特異地下調細胞中基因的表達，用于研究某個特定基因在特定階段的功能。為了深入探討ERp29基因在腸上皮細胞電離輻射損傷修復中的作用，本課題以輻射敏感的腸上皮細胞株IEC-6為研究對象，通過RNA干擾抑制ERp29表達，旨在探討抑制E

5、Rp29基因表達對IEC-6細胞放射損傷修復的影響。取得了如下結果： 一、成功構建重組質粒pAVU6-siERp29 選擇大鼠ERp29基因作為靶基因，根據(jù)靶序列選取的一般原則結合生物信息學，選取了一條對ERp29基因有效且特異的siRNA序列，體外合成帶有SalⅠ和XbaⅠ酶切位點的55nt寡核苷酸，經退火后形成shRNA，與SalⅠ和XbaⅠ酶切的線性化質粒pAVU6+27定向連接，轉化大腸桿菌DH10B。連接成功的

6、質粒命名為pAVU6-siERp29，另以空載體作為陰性對照，命名為pAVU6+27。這些質粒均經過酶切和測序鑒定。為了減少質粒中內毒素含量，提高轉染效率，本實驗將抽提的各組質粒均采用乙醇沉淀法純化后備用。 二、低表達ERp29細胞克隆的篩選鑒定 利用pAVU6+27質粒和IEC-6細胞摸索脂質體Lipofectamine2000的轉染條件，先后對細胞狀態(tài)、細胞融合度、質粒純度、DNA與脂質體的比例、實驗操作等多種因素進

7、行了優(yōu)化，在后續(xù)實驗中我們使用細胞融合度達90％、DNA與Lipofectamine2000比例為0.8ug∶2μ1的轉染條件，以獲得較高的轉染效率。轉染篩選實驗共分為三組：實驗組(IEC-siERp29)、陰性對照組(IEC-pAVU6)和未轉染組(僅加Lipofectamine2000)，經過致死劑量G418篩選和極低密度稀釋接種法，約4周后得到穩(wěn)定轉染的細胞克隆，在維持G418篩選壓力下逐步擴大培養(yǎng)，將篩選獲得的細胞進行轉染質粒的

8、PCR檢測，證實了pAVU6-siERp29質粒在實驗細胞中的存在。在此基礎上采用Westernblot檢測各組細胞ERp29的表達情況，結果顯示：陰性對照組與未轉染組相比，ERp29的表達差異不顯著，而實驗組ERp29表達明顯低于對照組細胞，為正常的28％，說明構建的ERp29基因RNA干擾質粒在篩選獲得的IEC-6細胞中發(fā)揮了作用。 三、ERp29的輻射保護作用 采用Westernblot檢測正常IEC-6細胞電離輻

9、射后ERp29的表達情況，我們發(fā)現(xiàn)：不同劑量照射后ERp29表達均高于電離輻射前；5Gy時ERp29表達隨照射后時間的增加有增加的趨勢；電離輻射后ERp29表達與照射劑量之間沒有明顯的量效關系。從形態(tài)學觀察低表達ERp29腸上皮細胞，細胞貼壁，呈多角形，折光性較好，少量細胞脫壁、懸浮。采用流式技術檢測細胞周期顯示：59.26％處于生長前期(G1)，21.09％處于DNA合成期(S)，生長后期(G2)占19.65％，凋亡占3.34％。說明

10、大部分細胞生長狀況良好，只有少數(shù)細胞凋亡。MTT檢測篩選細胞的增殖活性，結果顯示：實驗組細胞增殖明顯低于對照組，說明ERp29對正常IEC-6細胞具有增殖調控作用。在此基礎上觀察電離輻射后低表達ERp29腸上皮細胞的形態(tài)學變化，結果發(fā)現(xiàn)：γ射線照射后，大量細胞脫壁、懸浮，貼壁的細胞仍呈多角形，其中實驗組較對照組細胞死亡嚴重，時間較早，數(shù)量較多；陰性對照組和未轉染組細胞死亡差別不顯著。同樣采用MTT法檢測在10Gy和20Gy照射劑量時實驗

11、組和對照組的差異，結果顯示：實驗組細胞存活數(shù)目較對照組明顯降低；10Gy和20Gy照射后實驗組細胞存活數(shù)目低于照射前；照射后實驗組細胞存活率隨照射后時間的增加而減少；未轉染組與陰性對照組細胞存活均無顯著差異。初步證實了ERp29是一個電離輻射所致的效應分子，具有輻射保護作用。為了準確反映離體細胞存活率，采用細胞克隆計數(shù)法，觀察ERp29在低表達狀態(tài)下細胞活性，結果顯示：經2Gy、4Gy和6Gyγ射線照射后，實驗組細胞克隆數(shù)及克隆形成率較

12、對照組顯著降低，且各組細胞克隆數(shù)隨著照射劑量的增加而減少，各照射劑量下未轉染組與陰性對照組細胞活力均無顯著差異。說明抑制ERp29基因在IEC-6細胞中的表達可以降低電離輻射后細胞活性，進一步證明ERp29具有輻射保護作用。 結論: 一、有效的體外合成siRNA可適用于質粒載體介導的RNA干擾，具有長期表達的優(yōu)勢，大大提高實驗效率，有利于長期深入研究基因功能。 二、針對ERp29基因的RNA干擾表達載體穩(wěn)定轉染I

13、EC-6細胞后，能夠特異性抑制該基因表達，沉默效率72％，為功能研究提供了低表達ERp29的細胞平臺。 三、蛋白水平檢測電離輻射后ERp29表達增高，但與照射劑量之間無明顯量效關系，提示電離輻射誘導腸上皮細胞高表達ERp29，為內源性輻射保護效應。 四、轉染pAVU6-siERp29后IEC-6細胞增殖明顯降低，說明ERp29對正常腸上皮細胞具有增殖調控作用。 五、在ERp29基因表達抑制的基礎上，電離輻射后實驗

14、組細胞較對照組死亡嚴重，時間較早，數(shù)量較多；MTT檢測和克隆形成實驗結果顯示實驗組細胞存活率和細胞活性較陰性對照組及未轉染組明顯降低，初步證明了ERp29具有輻射保護作用，提示該基因可作為電離輻射損傷修復的靶點。 電離輻射可引起內質網(wǎng)應激反應，而ERp29作為內質網(wǎng)應激相關蛋白，是一電離輻射所致的效應分子，初步的實驗結果證實其促進細胞增殖，具有輻射保護作用，推測ERp29在輻射誘導的內質網(wǎng)應激中發(fā)揮作用，但作用機制還有待下一步深