豬α干擾素的原核表達及重組桿狀病毒載體的構(gòu)建.pdf

1、無菌采集健康豬的前腔靜脈血，分離培養(yǎng)淋巴細胞，加入ConA誘導培養(yǎng)后，提取總RNA，參照GenBank上豬a干擾素基因序列設計一對引物，應用RT-PCR克隆不含信號肽的豬α干擾素的基因片段，插入pGEM-T Easy載體中，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細胞，篩選陽性菌株，并進行測序，測序結(jié)果用DNAstar軟件分析，獲得的基因片段大小為498bp，編碼166個成熟氨基酸，其核苷酸同源性與GenBank上登陸的豬α干擾素基因均在97.0％以上。

2、 用EcaRⅠ和HindⅢ雙酶切質(zhì)粒pGEM-T-pIFNα，回收目的基因片段，插入到原核表達載體pET32a中，構(gòu)建豬α干擾素原核表達載體pET32a-pIFN-α，轉(zhuǎn)化宿主菌BL21(DE)進行豬α干擾素的表達，SDS-PAGE電泳圖譜中出現(xiàn)分子量大小40.2 kD的特異性條帶，同預期結(jié)果一致。經(jīng)過優(yōu)化IPTG的濃度和誘導時間，豬α干擾素的表達量明顯提高，表達量約占細菌總蛋白量的20％。應用鎳瓊脂糖凝膠樹脂層析柱吸附純化豬α干

3、擾素融合蛋白，不同濃度的咪唑緩沖液洗脫吸附蛋白，SDS-PAGE電泳鑒定表明，400mM咪唑的緩沖液洗脫的豬α干擾素蛋白。純度最高，達到蛋白純化的預期目的，可以用于抗病毒活性試驗。 純化后的豬α干擾素融合蛋白作用于鋪滿單層的豬肺巨噬細胞，24h后接種100TCID50豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒(PRRSV)。設PRRSV感染的巨噬細胞為陽性對照，正常的巨噬細胞為陰性對照。間接免疫熒光技術檢測PRRSV抗原，檢測結(jié)果顯示，陽性對照

4、，出現(xiàn)明顯的黃綠色熒光：豬a干擾素作用的巨噬細胞，在PRRSV感染后，無特異熒光；陰性對照，沒有出現(xiàn)特異熒光。 將克隆的豬α干擾素連接到供體載體pFastBac Dual中，轉(zhuǎn)化JM109，經(jīng)過PCR、酶切和基因測序等技術進行篩選，構(gòu)建了重組供體載體pFastBac Dual-pIFN-α。重組供體載體pFastBac Dual-pIFN-α轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10 Bac，經(jīng)過卡那霉素、四環(huán)素、慶大霉素、x-gal和IPTG的多重