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文檔簡介
1、目的:建立原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞液壓沖擊損傷模型,利用雙向電泳結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)觀察腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細胞液壓沖擊損傷后蛋白質(zhì)組的表達變化,探尋腦損傷的特異性生物標志蛋白。 方法:取出生后24h內(nèi)SD大鼠(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供)大腦皮質(zhì)組織,于含有10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基中進行星形膠質(zhì)細胞體外分離培養(yǎng)和純化,并以膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)免疫細胞化學(xué)染色進行純度鑒定。隨機將細胞分為對照組和損傷后4h、8h、12h、
2、24h、48h組,復(fù)制Scott's細胞液壓沖擊損傷模型(0.2MPa)。用臺盼藍染色觀察星形膠質(zhì)細胞損傷前后形態(tài)學(xué)變化,測培養(yǎng)液中LDH活力反映細胞的損傷程度,PI/Hoechst33342染色進行凋亡分析。提取細胞總蛋白,經(jīng)雙向電泳和MALDL-TOF質(zhì)譜分析鑒定差異蛋白質(zhì)。 結(jié)果: 1.星形膠質(zhì)細胞原代培養(yǎng)和純化:經(jīng)2-3次搖床傳代純化培養(yǎng)后的星形膠質(zhì)細胞形態(tài)均一,胞體較大而扁、胞質(zhì)較豐富、形狀不規(guī)則;胞突豐富、分
3、支多呈放射狀,一級胞突較粗,常有二級分支;胞核圓形或橢圓形,常偏于胞體一側(cè)。培養(yǎng)至24-26d,細胞生長狀態(tài)良好,鋪滿皿底,形成大致均一的扁平細胞層。 2.星形膠質(zhì)細胞的純度鑒定:采用GFAP免疫細胞化學(xué)染色(SP法),計數(shù)結(jié)果顯示培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞純度可達94.9%±1.9%。 3.液壓沖擊損傷后星形膠質(zhì)細胞形態(tài)學(xué)的改變:光鏡下觀察,細胞隨時間發(fā)生間隙增大、腫脹、變圓、恢復(fù),部分細胞發(fā)生皺縮、胞膜破裂、脫壁等顯著的形態(tài)
4、學(xué)改變;PI/Hoechst33342(1:1)熒光雙染可見凋亡細胞。 4液壓沖擊損傷后細胞培養(yǎng)液中LDH的變化:與正常對照組細胞培養(yǎng)液相比,損傷后各組細胞培養(yǎng)液中LDH活力均降低,4h組降至最低,與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。然后其它組逐漸上升,48h組與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。 5 液壓沖擊損傷后星形膠質(zhì)細胞雙向電泳圖譜分析:雙向電泳圖譜經(jīng)PDquest軟件分析檢測到的各組總蛋白點數(shù):對照
5、組1369±56,4h組1325±94,8h組1136±81,12h組1197±112,24h組1257±63,48h組1176±73。蛋白點多分布于pI5.2-6.6、MW30kDa-70kDa的范圍;以對照組為參考膠,平均圖譜匹配率達82%以上。損傷后共有265個蛋白質(zhì)點的相對強度與正常對照組相比有顯著性差異(P<0.05),其中38個蛋白質(zhì)點在損傷后表達升高,111個蛋白質(zhì)點在損傷后表達下降,45個蛋白質(zhì)點為損傷后新表達,有71個
6、蛋白質(zhì)點在損傷后各組均未表達。 6 差異蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定:對9個差異蛋白點行MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定,其中8個點得分大于61分(P<0.05),分別為60S酸性核糖體蛋白P2(60S acidic ribosomal protein P2)、細胞視黃醇結(jié)合蛋白(cellular retinol binding protein,Crbp)、腦脂肪酸結(jié)合蛋白7(brain fatty acid binding protein 7,
7、FABP7)、S-100鈣結(jié)合蛋白A11(S100 calcium binding protein A11,S100A11)、假設(shè)蛋白LOC685814(hypothetical protein LOC685814)、真核生物翻譯起始因子1A(Eukaryotic translation initiation factor 1A,eIF-1A)、乳腺癌擴增序列2同源體(Breast carcinoma amplified sequenc
8、e 2 homolog,BCAS2)、鈣結(jié)合蛋白3(calponin 3)。其中對FABP7行Western-blot驗證,結(jié)果顯示:FABP7在星形膠質(zhì)細胞中存在表達,而且該蛋白在星形膠質(zhì)細胞液壓沖擊損傷后的變化趨勢與雙向電泳圖像經(jīng)PDQuest軟件分析后得到的蛋白質(zhì)變化趨勢相一致。 結(jié)論: 1.液壓沖擊損傷可引起星形膠質(zhì)細胞形態(tài)學(xué)發(fā)生改變,且有一定的時間依從性。 2.液壓沖擊損傷能導(dǎo)致星形膠質(zhì)細胞蛋白質(zhì)組表達
9、發(fā)生變化,損傷后共有265個蛋白點的相對強度與正常對照組相比有顯著性差異,對其深入研究,有可能探尋到腦損傷的生物標志蛋白。 3.經(jīng)MALDL-TOF質(zhì)譜分析初步確定的8種蛋白大致分為代謝調(diào)節(jié)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)、翻譯起始相關(guān)類及其它等四類,這些蛋白表達的變化表明它們在參與星形膠質(zhì)細胞損傷后早期反應(yīng)、促進細胞功能恢復(fù)、抑制細胞繼發(fā)性損傷、參與細胞骨架組織重組及改善蛋白質(zhì)合成等環(huán)節(jié)起重要作用,對其進行進一步研究,有望深入了解腦損傷的分子機
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