原代培養(yǎng)大鼠腦星形膠質(zhì)細胞液壓沖擊損傷后蛋白差異性表達的研究.pdf

1、目的：建立原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞液壓沖擊損傷模型，利用雙向電泳結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)觀察腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細胞液壓沖擊損傷后蛋白質(zhì)組的表達變化，探尋腦損傷的特異性生物標志蛋白。 方法：取出生后24h內(nèi)SD大鼠(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供)大腦皮質(zhì)組織，于含有10％胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基中進行星形膠質(zhì)細胞體外分離培養(yǎng)和純化，并以膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)免疫細胞化學(xué)染色進行純度鑒定。隨機將細胞分為對照組和損傷后4h、8h、12h、

2、24h、48h組，復(fù)制Scott's細胞液壓沖擊損傷模型(0.2MPa)。用臺盼藍染色觀察星形膠質(zhì)細胞損傷前后形態(tài)學(xué)變化，測培養(yǎng)液中LDH活力反映細胞的損傷程度，PI/Hoechst33342染色進行凋亡分析。提取細胞總蛋白，經(jīng)雙向電泳和MALDL-TOF質(zhì)譜分析鑒定差異蛋白質(zhì)。 結(jié)果： 1.星形膠質(zhì)細胞原代培養(yǎng)和純化：經(jīng)2-3次搖床傳代純化培養(yǎng)后的星形膠質(zhì)細胞形態(tài)均一，胞體較大而扁、胞質(zhì)較豐富、形狀不規(guī)則；胞突豐富、分

3、支多呈放射狀，一級胞突較粗，常有二級分支；胞核圓形或橢圓形，常偏于胞體一側(cè)。培養(yǎng)至24-26d，細胞生長狀態(tài)良好，鋪滿皿底，形成大致均一的扁平細胞層。 2.星形膠質(zhì)細胞的純度鑒定：采用GFAP免疫細胞化學(xué)染色(SP法)，計數(shù)結(jié)果顯示培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞純度可達94.9％±1.9％。 3.液壓沖擊損傷后星形膠質(zhì)細胞形態(tài)學(xué)的改變：光鏡下觀察，細胞隨時間發(fā)生間隙增大、腫脹、變圓、恢復(fù)，部分細胞發(fā)生皺縮、胞膜破裂、脫壁等顯著的形態(tài)

4、學(xué)改變；PI/Hoechst33342(1:1)熒光雙染可見凋亡細胞。 4液壓沖擊損傷后細胞培養(yǎng)液中LDH的變化：與正常對照組細胞培養(yǎng)液相比，損傷后各組細胞培養(yǎng)液中LDH活力均降低，4h組降至最低，與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。然后其它組逐漸上升，48h組與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。 5 液壓沖擊損傷后星形膠質(zhì)細胞雙向電泳圖譜分析：雙向電泳圖譜經(jīng)PDquest軟件分析檢測到的各組總蛋白點數(shù)：對照

5、組1369±56，4h組1325±94，8h組1136±81，12h組1197±112，24h組1257±63，48h組1176±73。蛋白點多分布于pI5.2-6.6、MW30kDa-70kDa的范圍；以對照組為參考膠，平均圖譜匹配率達82％以上。損傷后共有265個蛋白質(zhì)點的相對強度與正常對照組相比有顯著性差異(P＜0.05)，其中38個蛋白質(zhì)點在損傷后表達升高，111個蛋白質(zhì)點在損傷后表達下降，45個蛋白質(zhì)點為損傷后新表達，有71個

6、蛋白質(zhì)點在損傷后各組均未表達。 6 差異蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定：對9個差異蛋白點行MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定，其中8個點得分大于61分(P＜0.05)，分別為60S酸性核糖體蛋白P2(60S acidic ribosomal protein P2)、細胞視黃醇結(jié)合蛋白(cellular retinol binding protein，Crbp)、腦脂肪酸結(jié)合蛋白7(brain fatty acid binding protein 7，

7、FABP7)、S-100鈣結(jié)合蛋白A11(S100 calcium binding protein A11，S100A11)、假設(shè)蛋白LOC685814(hypothetical protein LOC685814)、真核生物翻譯起始因子1A(Eukaryotic translation initiation factor 1A，eIF-1A)、乳腺癌擴增序列2同源體(Breast carcinoma amplified sequenc

8、e 2 homolog,BCAS2)、鈣結(jié)合蛋白3(calponin 3)。其中對FABP7行Western-blot驗證，結(jié)果顯示：FABP7在星形膠質(zhì)細胞中存在表達，而且該蛋白在星形膠質(zhì)細胞液壓沖擊損傷后的變化趨勢與雙向電泳圖像經(jīng)PDQuest軟件分析后得到的蛋白質(zhì)變化趨勢相一致。 結(jié)論： 1.液壓沖擊損傷可引起星形膠質(zhì)細胞形態(tài)學(xué)發(fā)生改變，且有一定的時間依從性。 2.液壓沖擊損傷能導(dǎo)致星形膠質(zhì)細胞蛋白質(zhì)組表達

9、發(fā)生變化，損傷后共有265個蛋白點的相對強度與正常對照組相比有顯著性差異，對其深入研究，有可能探尋到腦損傷的生物標志蛋白。 3.經(jīng)MALDL-TOF質(zhì)譜分析初步確定的8種蛋白大致分為代謝調(diào)節(jié)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)、翻譯起始相關(guān)類及其它等四類，這些蛋白表達的變化表明它們在參與星形膠質(zhì)細胞損傷后早期反應(yīng)、促進細胞功能恢復(fù)、抑制細胞繼發(fā)性損傷、參與細胞骨架組織重組及改善蛋白質(zhì)合成等環(huán)節(jié)起重要作用，對其進行進一步研究，有望深入了解腦損傷的分子機