腎移植急性排斥反應IL-15、穿孔素及顆粒酶B mRNA表達的實驗與臨床研究.pdf

1、盡管近年來免疫抑制劑種類不斷增加，但移植后急性排斥反應（acute rejection，AR）仍然是導致移植腎失功的重要原因。急性排斥反應的早期診斷及干預，對移植腎功能的恢復至關重要。雖然移植腎穿刺活檢仍然是診斷的金標準，但大部分臨床醫(yī)生以及患者更愿意接受非侵襲性的診斷方法。隨著對急性排斥反應分子生物學的深入研究，細胞因子在器官移植急性排斥反應的發(fā)生和發(fā)展中的作用受到廣泛重視。移植術后對某些細胞因子的表達進行檢測并干預以防治急性排斥反應

2、是當前器官移植領域的研究熱點。 已知白細胞介素2（IL—2）在腎移植AR中起重要作用，通過抑制IL—2受體（IL—2R）能有效的預防AR。但是即使如此，動物實驗和臨床移植中阻斷IL—2/IL—2R仍不可能完全控制AR的發(fā)生，說明機體內存在有獨立于IL—2/IL—2R系統(tǒng)之外的其他的T細胞激活途徑。白細胞介素15（IL—15）是由單核細胞、樹突狀細胞等非T淋巴細胞分泌的細胞因子，最近的研究表明，它是CD8記憶T細胞增殖和活化的重要

3、因子，在肝臟移植的急性排斥反應早期，可以檢測到IL—15的表達高表達。穿孔素和顆粒酶B是細胞毒性T細胞分泌的因子，在急性排斥反應發(fā)生時被釋放并攻擊移植物。雖然對腎移植早期急性排斥反應時穿孔素（PFP）和顆粒酶B（GraB）的檢測已有研究報道，但對于IL—15在腎移植AR發(fā)生時的作用以及它與PFP和GraB表達的關聯(lián)性尚未見報道。本研究在動物實驗和臨床試驗中探討了IL—15、PFP和GraB在腎移植AR發(fā)生時的表達變化，以及IL—15在其

4、中的作用。研究分三個部分： 第一部分:建立大鼠同種異體腎移植模型 目的：建立穩(wěn)定的同種異體大鼠腎移植模型，為開展大鼠腎移植相關研究奠定良好的實驗基礎。 方法：分別采用WISTAR大鼠和SD大鼠作為供受體，將供腎動脈帶有的腹主動脈瓣與受體腹主動脈作端側二定點外翻連續(xù)縫合；供體腎靜脈帶有的下腔靜脈瓣與受體下腔靜脈作端側兩定點外翻連續(xù)縫合。尿路重建采用供體輸尿管膀胱瓣與受體膀胱吻合。 結果：手術總時間平均為（9

5、0±10）min。手術成功率為86%。 結論：此模型有較高的成功率和AR發(fā)生率，符合大鼠腎移植實驗研究的需要。 第二部分:阻斷IL—15對大鼠腎臟移植急性排斥反應細胞毒性作用的研究 目的:研究阻斷IL—15對大鼠腎臟移植急性排斥反應細胞毒性作用的影響。 方法：分別以WISTAR大鼠和SD大鼠作為供受體，建立大鼠同種異體腎移植模型。實驗分四組（n≥15/組）：（1）同基因移植組（對照組，Ctrl）；（2）急

6、性排斥反應（AR）組，術后無藥物處理；（3）環(huán)孢素A（CsA）治療組，術后經腹腔注射CsA針劑6mg.kg—1.d—1；（4）IL—15抗體（AB）治療組，術后經腹腔注射IL—15抗體0.5mg/kg。以real—time PCR方法分別檢測受體外周血和移植腎組織中IL—15、PFP和GraB的mRNA表達，并作移植腎AR病理學分析研究。 結果：（1）AR、CsA及AB組術后移植腎組織及外周血中均出現(xiàn)IL—15、PFP和GraB

7、 mRNA表達水平上調，第3～5天達到高峰，第7天逐漸下降，與Ctrl組相比差異有統(tǒng)計學意義；（2）AR組與AB和CsA組比較，移植腎組織及外周血中IL—15、PFP和GraB mRNA表達均明顯上調，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），其中PFP和GraB mRNA表達上調較IL—15 mRNA更為明顯（P<0.05）；（3）AB組與AR組及CsA組比較，移植腎組織及外周血中IL—15 mRNA表達均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.

8、05）；（4）移植腎病理組織檢查，Ctrl組和CsA組未見明顯AR征象，AR組呈現(xiàn)重度AR反應，AB組AR征象較輕微。（5）三個細胞因子的表達變化在移植腎組織和外周血中差異無顯著意義。 結論：（1）AR發(fā)生早期IL—15、PFP和GraB在移植腎組織及外周血中均出現(xiàn)表達上調，IL—15可能是存在與IL—2之外的參與AR發(fā)生的另一途徑；（2）AR發(fā)生時IL—15 mRNA的高表達與GraB和PFP的mRNA表達上調之間存在密切關聯(lián)

9、：（3）AR早期阻斷受體內IL—15的表達，可降低GraB和PFP mRNA的表達，并抑制它們引起的細胞毒殺傷作用，從而保護移植物，減輕AR程度。（4）GraB、PFP和IL—15 mRNA的高表達可以作為診斷同種異體腎移植AR早期的重要指標。檢測受體外周血中IL—15、PFP和GraB的mRNA表達水平，可以作為早期診斷AR的一種非侵襲性的檢測方法。并且對判斷AR的程度、治療效果及預后均有一定的指導價值。 第三部分:腎移植急性

10、排斥反應患者血清白細胞介素15、穿孔素及顆粒酶B mRNA的表達 目的:探討IL—15、PFP和GraB mRNA檢測在腎移植術后早期AR診斷及其與感染鑒別診斷中的價值。 方法：采用SYBR GreenⅠ實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（FQ—PCR）方法動態(tài)檢測45例腎移植患者外周血淋巴細胞（PBL）中IL—15、PFP及GraB mRNA表達的變化。 結果：（1）AR組IL—15、PFP及GraB mRNA的表

11、達均高于術前及腎功能穩(wěn)定組（P<0.05），較臨床癥狀出現(xiàn)早2～3天，經激素沖擊治療后，AR均得到逆轉，同時PFP、GraB和IL—15 mRNA的表達減弱（P<0.05）。（2）與術前及腎功能穩(wěn)定組比較，細菌感染組PFP和GraB mRNA的表達水平亦上升（P<0.05），抗感染治療后表達水平下調。但IL—15 mRNA的表達水平均未見明顯升高（P>0.05）。（3）CsA中毒組三項指標在監(jiān)測過程中均未見明顯變化。 結論：

12、 1.FQ—PCR動態(tài)測定PBL中IL—15、PFP及GraB mRNA表達是一種無創(chuàng)、較敏感的早期檢測AR的方法，并可以預測抗AR的治療效果。 2.IL—15作為CD8記憶T細胞生長和活化必須的細胞因子，可能是介導AR發(fā)生的重要因子。 3.IL—15 mRNA的表達水平在細菌感染發(fā)生時并不升高，而PFP和GraB卻在患者發(fā)生AR和細菌感染時均有表達上調，因此同時檢測這三個細胞因子，才能對AR和細菌感染作出鑒別診斷有