DNA甲基化在鼻咽癌紫杉醇耐藥形成機制中的初步研究.pdf

1、第一章DNA甲基化芯片聯(lián)合表達譜芯片篩選鼻咽癌紫杉醇耐藥相關基因
　　 目的:探討DNA甲基化與鼻咽癌紫杉醇耐藥的相關性，采用DNA甲基化芯片聯(lián)合基因表達譜芯片技術(shù)檢測鼻咽癌紫杉醇耐藥細胞系CNE-1/Taxol、HNE-2/Taxol和5-8F/Taxol與相應親本細胞的甲基化譜和基因表達譜差異，并篩選出鼻咽癌紫杉醇耐藥相關基因。
　　 方法:使用高效液相色譜技術(shù)(HPLC)檢測鼻咽癌細胞整體甲基化水平，回歸性分析DN

2、A甲基化與鼻咽癌紫杉醇的耐藥相關性。采用NimbleGen HG18甲基化芯片和Affymetrix HG-U133 Plus2.0基因表達譜芯片分別分析鼻咽癌耐藥細胞的甲基化譜和基因表達譜系，并結(jié)合DNA甲基化芯片和基因表達譜芯片結(jié)果分析鼻咽癌紫杉醇耐藥相關基因。篩選出來的候選基因通過在線生物分析軟件進行GO功能分類和KEGG信號通路分析，同時進一步通過甲基化特異性PCR(MS-PCR)和熒光實時定量PCR（Real-time PCR

3、）進行驗證。
　　 結(jié)果:鼻咽癌耐藥細胞CNE-1/Taxol、HNE-2/Taxol和5-8F/Taxol均呈整體高甲基化狀態(tài)，并隨腫瘤細胞對紫杉醇耐藥性的增強其甲基化水平增高。進一步回歸性分析顯示DNA甲基化與紫杉醇耐藥性呈正相關。三個耐藥細胞系中DNA甲基化芯片篩選出117個甲基化共同差異基因，其中高甲基化基因83個(70.94％)，低甲基化基因34個(29.04％)。表達譜芯片篩選三個耐藥細胞系中共同表達差異的基因有32

4、7個，其中表達上調(diào)基因129個(39.45％)，表達下調(diào)基因198個(60.55％)。結(jié)合兩種芯片結(jié)果篩選，獲得具有甲基化差異并且表達顯著改變的基因有48個。其中高甲基化、表達下調(diào)基因13個，低甲基化、表達上調(diào)基因14個。MS-PCR和Real-time PCR驗證篩選的6個候選基因(CHFR、PEG10、ABCC5、 CDKN1C、 DLC1及ERBB2)，結(jié)果與甲基化芯片以及表達譜芯片一致。
　　 結(jié)論:DNA甲基化與鼻咽癌

5、紫杉醇耐藥形成密切相關，DNA異常甲基化后的耐藥相關基因表達改變導致腫瘤耐藥的形成。DNA甲基化芯片聯(lián)合基因表達譜芯片分析鼻咽癌紫杉醇耐藥的方法能夠有效、特異性地篩選耐藥相關基因，是研究腫瘤耐藥的一種非常好的手段。篩選出的候選基因通過功能分類和信號通路分析，被證明大部分參與了腫瘤耐藥形成機制。 CHFR、PEG10、ABCC、GSTP1、LC1及ERBB經(jīng)過驗正可能成為特異的腫瘤耐藥標志。
　　 第二章5-aza-dC逆轉(zhuǎn)鼻咽癌

6、紫杉醇耐藥性研究
　　 目的:觀察5-aza-dC對鼻咽癌親本細胞系（CNE-1、HNE-2和5-8F）和耐藥細胞系（CNE-1/Taxol、HNE-2/Taxol和5-8F/Taxol）的生長抑制作用，并比較其差異。初步研究5-aza-dC對鼻咽癌紫杉醇耐藥細胞耐藥性的影響。
　　 方法:集落形成試驗檢測5-aza-dC單藥及5-aza-dC聯(lián)合紫杉醇干預鼻咽癌親本和耐藥細胞后對細胞增殖的影響，并觀察5-aza-dC逆

7、轉(zhuǎn)鼻咽癌紫杉醇耐藥性的作用。運用Hochest染色法、流式細胞儀檢測分析順鉑對細胞凋亡和細胞周期的影響。
　　 結(jié)果:不同濃度梯度的5-aza-dC(0uM、1uM、2uM、5uM、10uM、15uM、20uM、25uM、30uM)對鼻咽癌親本和耐藥細胞增殖均有抑制作用，測得親本細胞CNE-1、HNE-2和5-8F的IC50值分別為:9.7±0.2uM、10.5±0.6uM、11.2±0.5uM;耐藥細胞系CNE-1/Taxol

8、、HNE-2/Taxol和5-8F/Taxol的IC50值分別為:4.9±0.3uM、5.3±0.2uM、6.1±0.3uM。結(jié)果顯示5-aza-dC對紫杉醇耐藥細胞系的抑制作用明顯高于親本細胞(p＜0.01)。5uM5-aza-dC預處理后紫杉醇對CNE-1/taxol、HNE-2/Taxol和5-8F/Taxol生長抑制的IC50值分別為4.87±0.29nM、5.35±0.24、5.79±0.34，耐藥指數(shù)分別為3.43±0.11

9、、3.86±0.13、4.53±0.17其敏感性顯著增加(p＜0.01)，而親本細胞對紫杉醇的敏感性無明顯變化(P＞0.05)。流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)經(jīng)5-aza-dC處理的鼻咽癌耐藥細胞，G0/G1期比例增加，凋亡比例增高，且顯著高于親本細胞系(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:5-aza-dC對鼻咽癌親本及紫杉醇耐藥細胞增殖均有抑制作用，紫杉醇耐藥細胞對具有更高的敏感性。5-aza-dC處理后耐藥細胞對紫杉醇藥物的敏感性明顯增加，從

10、而可以部分逆轉(zhuǎn)鼻咽癌對紫杉醇的化療耐藥。
　　 第三章5-aza-dC逆轉(zhuǎn)鼻咽癌紫杉醇耐藥機制研究
　　 目的:初步探討篩選出的候選基因CHFR、PE G10、ABCC5、 GSTP1、DLC1及ERBB2在鼻咽癌紫杉醇耐藥及耐藥逆轉(zhuǎn)中的作用。
　　 方法:MS-PCR檢測5-aza-dC作用對候選基因甲基化狀態(tài)的影響。并通過Real-time PCR和western blot，在mRNA及蛋白質(zhì)水平對基因的表達

11、進行驗證，同時觀察不同劑量5-aza-dC和紫杉醇處理對耐藥細胞基因的表達影響。
　　 結(jié)果:5-aza-dC對高甲基化基因CHFR、PEG10及DLC1具有去甲基化作用，但對低甲基化基因ABCC、GSTP1及ERBB2甲基化狀態(tài)無明顯影響。鼻咽癌紫杉醇耐藥細胞表達下調(diào)基因CHFR、PEG10DL C1經(jīng)不同濃度5-aza-dC處理后mRNA及蛋白表達均顯著增強(p＜0.01)，而低甲基化基因ABCC5、 GSTP1及ERBB2