沃頓膠間充質干細胞對APP-PS1雙轉基因小鼠的作用及其相關機制研究.pdf

1、目的：
　　本研究以APP/PS1雙轉基因小鼠為模型，研究尾靜脈注射WJ-MSCs對AD的保護作用及其作用機制;WJ-MSCs與脾淋巴細胞體外共培養(yǎng)3天，研究WJ-MSCs是否可以在體外調節(jié)調節(jié)性T細胞的比例和/或功能;利用WJ-MSCs與自體小鼠脾淋巴細胞共培養(yǎng)后分選的CD4+CD25+調節(jié)性T細胞心內注射移植至APP/PS1雙轉基因小鼠，研究其對APP/PS1小鼠的作用及其作用機制。
　　方法：
　　1.為明確WJ

2、-MSCs對AD動物模型的作用及其作用機制，取足月剖宮產胎兒的臍帶組織，分離得到WJ-MSCs后傳代擴增。用6月齡的APP/PS1雙轉基因小鼠為模型，分為對照組和WJ-MSCs治療組。WJ-MSCs組給予2×106/200ul個WJ-MSCs尾靜脈注射，對照組給予200ulPBS尾靜脈注射。3周后利用Morris水迷宮進行小鼠的行為學測試，觀察并記錄小鼠尋找并爬上平臺所需時間（逃避潛伏期）檢測小鼠的學習能力，進行空間探索實驗檢測小鼠的記

3、憶能力。治療后4周采用硫磺素S染色法，檢測小鼠腦冰凍切片老年斑的沉積，并采用Elisa法定量檢測腦內可溶性的Aβ40及Aβ42水平。在治療后的第1天和4周采用ELISA法檢測血清和腦內抗炎因子IL-10含量;采用免疫組織化學染色檢測小膠質細胞標志物Iba1的含量;實時定量PCR檢測小鼠腦中促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA水平，并采用ELISA法檢測小鼠腦中IL-1β、TNF-α的蛋白含量。
　　2.為明確WJ-M

4、SCs是否可以在體外調節(jié)調節(jié)性T細胞的比例和/或功能，取足月剖宮產胎兒的臍帶組織，分離得到WJ-MSCs后傳代擴增。為明確與WJ-MSCs共培養(yǎng)后Tregs是否具有免疫抑制功能，我們把純化的共培養(yǎng)后和未共培養(yǎng)的CD4+CD25+調節(jié)性T細胞分別與CFSE標記的同種異體脾淋巴細胞在含有PHA(10ug/ml)培養(yǎng)基中體外共培養(yǎng)3天，用流式細胞儀和ModFit軟件分析細胞增殖指數。
　　3.為明確與WJ-MSCs共培養(yǎng)后分選的CD4+

5、CD25+調節(jié)性T細胞移植對AD動物模型的作用及其作用機制，從與WJ-MSCs共培養(yǎng)后的小鼠脾淋巴細胞純化的CD4+CD25+調節(jié)性T細胞通過心內注射至APP/PS1雙轉基因小鼠(n=15)，首次劑量為0.5×106個細胞/100ulPBS。然后一周后以0.2×106個細胞/100ulPBS劑量進行第二次注射。另一組APP/PS1雙轉基因小鼠(n=15)注射相同劑量PBS作為對照組。第一次注射3周后，注射CD4+CD25+調節(jié)性T細胞組

6、(n=15)、PBS組(n=15)的APP/PS1雙轉基因小鼠利用Morris水迷宮試驗進行行為學測試:觀察并記錄小鼠尋找并爬上平臺所需時間（逃避潛伏期）檢測小鼠的學習能力，進行空間探索實驗檢測小鼠的記憶能力。在Morris水迷宮試驗后，用ELISA法檢測血清促炎細胞因子IFN-γ和抗炎細胞因子（IL-10和TGF-β1）的水平。第一次注射4周后，采用硫磺素S染色法，檢測小鼠腦冰凍切片老年斑的沉積，并采用Elisa法定量檢測腦內可溶性的

7、Aβ40及Aβ42水平;使用Iba-1抗體標記小膠質細胞并通過熒光免疫組織化學方法分析APP/PS1雙轉基因小鼠腦內小膠質細胞的狀態(tài)。
　　結果：
　　1.WJ-MSCs對AD動物模型的神經保護作用及其作用機制
　　1.1 WJ-MSCs改善了APP/PS1雙轉基因小鼠的學習和記憶能力。
　　1.2 WJ-MSCs明顯降低了APP/PS1雙轉基因小鼠腦內老年斑的沉積和可溶性Aβ的水平。
　　1.3 WJ-M

8、SCs對APP/PS1雙轉基因小鼠的神經保護作用的機制研究
　　1.3.1 WJ-MSCs增加了APP/PS1雙轉基因小鼠血清及腦內抗炎因子IL-10的表達，抑制了炎癥反應。
　　1.3.2 WJ-MSCs抑制促炎性小膠質細胞激活，采用免疫組織化學染色檢測小膠質細胞標志物Iba-1的含量，結果顯示，尾靜脈注射WJ-MSCs第1天后，小鼠Iba-1陽性小膠質細胞數量較PBS對照組增加，干預后4周，WJ-MSCs干預組Iba-1

9、陽性小膠質細胞數量較對照組減少。提示WJ-MSCs可能在治療后期抑制了促炎性小膠質細胞激活。
　　1.3.3 WJ-MSCs顯著降低了APP/PS1雙轉基因小鼠腦內促炎因子TNF-α和IL-1β的含量，但沒有改變IL-6的含量。在治療后第1天和4周，與PBS對照組比較，實時定量PCR檢測顯示AD小鼠腦中促炎因子IL-1β和TNF-α的mRNA水平在WJ-MSCs治療組均顯著降低，然而，兩組之間的小鼠腦中IL-6的表達無明顯改變。E

10、LISA檢測的數據顯示，與PBS對照組相比，小鼠腦內IL-1β、TNF-α蛋白的含量在WJ-MSCs治療組也顯著降低。
　　2.WJ-MSCs提高APP/PS1雙轉基因小鼠脾臟淋巴細胞中CD4+CD25+調節(jié)性T細胞的比例和功能
　　2.1 WJ-MSCs提高APP/PS1雙轉基因小鼠脾臟淋巴細胞中CD4+CD25+調節(jié)性T細胞的比例。WJ-MSCs與脾淋巴細胞在1∶5的比例（WJ-MSCs:脾淋巴細胞）體外共培養(yǎng)3天，流式

11、細胞儀檢測數據顯示，與無WJ-MSCs共培養(yǎng)的脾淋巴細胞相比，CD4+CD25+調節(jié)性T細胞在T淋巴細胞亞群中的比例顯著增加。
　　2.2 WJ-MSCs增強APP/PS1雙轉基因小鼠脾臟淋巴細胞中CD4+CD25+調節(jié)性T細胞的免疫抑制功能。
　　3.WJ-MSCs共培養(yǎng)后分選的CD4+CD25+調節(jié)性T細胞移植對AD動物模型的神經保護作用及其作用機制
　　3.1 WJ-MSCs共培養(yǎng)后分選的CD4+CD25+調節(jié)性

12、T細胞移植改善了APP/PS1雙轉基因小鼠的學習和記憶能力。
　　3.2 WJ-MSCs共培養(yǎng)后分選的CD4+CD25+調節(jié)性T細胞移植明顯降低了APP/PS1雙轉基因小鼠腦內老年斑的沉積和可溶性Aβ的水平。在第一次心內注射4周后，我們采用硫磺素S染色測量皮層和海馬老年斑沉積面積。結果顯示，WJ-MSCs共培養(yǎng)后分選的CD4+CD25+調節(jié)性T細胞移植后，皮層和海馬的老年斑面積和數量顯著減少。采用ELISA法定量檢測腦內可溶性的A

13、β40及Aβ42水平，結果顯示，WJ-MSCs共培養(yǎng)后分選的CD4+CD25+調節(jié)性T細胞治療能顯著降低APP/PS1雙轉基因小鼠腦內可溶性Aβ40和Aβ42的含量。以上結果表明WJ-MSCs共培養(yǎng)后分選的CD4+CD25+調節(jié)性T細胞移植顯著降低了APP/PS1雙轉基因小鼠腦內的Aβ水平。
　　3.3 WJ-MSCs共培養(yǎng)后分選的CD4+CD25+調節(jié)性T細胞移植對AD動物模型的神經保護作用機制的研究
　　3.3.1 WJ

14、-MSCs共培養(yǎng)后分選的CD4+CD25+調節(jié)性T細胞增加了APP/PS1雙轉基因小鼠血清抗炎因子IL-10和TGF-β1的水平，并顯著降低了APP/PS1雙轉基因小鼠血清促炎因子的水平，抑制了炎癥反應。在Morris水迷宮實驗后，用ELISA法檢測了血清促炎因子IFN-γ與血清抗炎細胞因子IL-10和TGF-β1的含量，結果顯示，與接受PBS的APP/PS1雙轉基因小鼠相比，WJ-MSCs共培養(yǎng)后分選的CD4+CD25+調節(jié)性T細胞治

15、療使小鼠血清抗炎細胞因子TGF-β1和IL-10的水平都顯著增加，并顯著降低了血清促炎因子IFN-γ的含量。
　　3.3.2 WJ-MSCs共培養(yǎng)后分選的CD4+CD25+調節(jié)性T細胞抑制了小膠質細胞的活化。第一次心內注射4周后，使用Iba-1抗體標記小膠質細胞并通過熒光免疫組織化學方法分析APP/PS1雙轉基因小鼠腦內小膠質細胞的狀態(tài)。我們觀察到，CD4+CD25+調節(jié)性T細胞治療后大多數的皮層小膠質細胞表現為細胞體較小，突起細

16、長，而用PBS處理后皮層小膠質細胞表現為胞體變大，突起變短，此外，我們發(fā)現，CD4+CD25+調節(jié)性T細胞治療顯著減少了活化的小膠質細胞的數量。
　　結論：
　　1.尾靜脈注射WJ-MSCs能夠改善APP/PS1雙轉基因小鼠的認知功能，降低小鼠腦內老年斑的沉積。
　　2.WJ-MSCs的作用機制與抑制炎癥反應有關，增加了抗炎因子的表達、降低了促炎因子的表達和抑制促炎性小膠質細胞的激活。
　　3.WJ-MSCs提高