樹鼩和人載脂蛋白A5基因的克隆表達和載脂蛋白A5以及載脂蛋白C3基因多態(tài)性研究.pdf

1、中國協(xié)和醫(yī)科大學博士學位論文樹鼩和人載脂蛋白A5基因的克隆表達和載脂蛋白A5以及載脂蛋白C3基因多態(tài)性研究姓名：李國平申請學位級別：博士專業(yè)：生物化學與分子生物學指導(dǎo)教師：陳保生20040601中國協(xié)和醫(yī)科大學中國醫(yī)學科學院博士學位論文引入＆oRj酶消化位點，設(shè)計下游引物引入皿DI酶消化位點，擴增后將PCR產(chǎn)物進行＆DRJ、j確oI雙酶消化，純化回收后與做同樣處理的原核表達載體pET30a連接。樹鼢APOA5在原核細胞中以融合形式高效表

2、達，蛋白表達量約為總蛋白量的346％。利用pET30a載體上Histag標簽，樹銅APOA5可以通過鎳離子螯合樹脂進行純化，純度可達80％以上，每升培養(yǎng)物可獲得純化蛋白13毫克。樹嘲APOA5基因成功的克隆表達，有利于進一步研究它的結(jié)構(gòu)和功能。為了比較樹懿和人APOA5基因的結(jié)構(gòu)與功能，同時克隆和表達了人載脂蛋白A5，并制備了抗人ApoA5多克隆抗體。人載脂蛋白A5的克隆、表達和純化的大致步驟如下：首先從人肝組織中提取總RNA，經(jīng)純化得

3、到mRNA，進一步逆轉(zhuǎn)錄成為cDNA第一鏈。為了下一步克隆，在上游引入NdeI酶消化位點，下游引入XhoI酶消化位點，以cDNA第一鏈為模板成功擴增了成熟APOA5基因的eDNA序列。擴增產(chǎn)物經(jīng)過雙酶消化后被精確連入原核表達載體pET30b。APOA5以包涵體的形式在大腸桿菌BL21(DE3)中大量表達，目的蛋白表達量約為菌體蛋白表達總量的289％。利用pET30b載體上Histag標簽，APOA5可通過鎳離子螯合樹脂進行純化，純化后純