酸性肽長期毒性及致癌性研究.pdf

1、背景和目的：自從1931年P物質被分離以來，已有眾多的內源性神經(jīng)肽被分離和研究。它們在神經(jīng)調節(jié)中有多種多樣的生物學功能，神經(jīng)肽作為新的藥物來源，正在受到人們廣泛重視。 本課題組從牛腦中分離出了一種新的酸性肽(acidpeptieAP)。它由3個谷氨酸構成。研究表明這種酸性肽具有明顯的生物學活性。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)酸性肽對癡呆小鼠和阿爾茨海默病(AD)模型大鼠有良好的治療作用。酸性肽能提高癡呆小鼠的學習記憶能力，并誘導超氧化物歧化酶(S∞)

2、活性升高和抑制丙二醛(MDA)的生成，酸性肽對AD模型大鼠能夠顯著降低其腦中一氧化氮(N0)和一氧化氮合酶(№S)的含量，減輕神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，有助于受損大腦的康復。實驗還發(fā)現(xiàn)，酸性肽有抗突變作用。急性毒性實驗證明該藥品安全范圍大，無急性毒性反應，口服耐受劑量大于5g／kg。 為進一步觀察酸性肽長期用藥后有無毒性，尋找可能的靶器官及停藥后組織和功能損害，為臨床安全用藥進行劑量設計，故對酸性肽的長期毒性和致癌性進行了實驗研究。

3、 方法： 一、酸性肽大鼠長期毒性實驗 根據(jù)國家新藥研制指導原則的長期毒性實驗方法和先前急性毒性實驗的口服給藥劑量大干5g/kg仍未產(chǎn)生毒性反應和死亡的結果，本實驗選用高出臨床擬用劑量50倍的劑量組，進行“限度實驗”。大鼠分兩個組：限度實驗組以1．5g／kg酸性肽溶液灌胃：正常對照組以同樣體積的蒸餾水灌胃。 給藥周期為3個月，每周7天連續(xù)給藥。給藥期間的一般觀察內容主要包括外觀體征和行為活動，發(fā)現(xiàn)異常如神態(tài)萎靡、

4、蜷縮不動或過度興奮、躁動驚跳、肌肉麻痹或震顫、步態(tài)異常、皮毛貼身或稀疏等，及時處理與記錄。 觀測指標包括血液檢查和病理檢查：血液檢查分為：1、血液學指標：包括紅細胞或網(wǎng)織紅細胞數(shù)、血紅蛋白、白細胞總數(shù)及分類、血小板計數(shù)、凝血時間，2、血液生化指標：包括天冬氨酸氨基轉移酶(AST或SGOT)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT或SGPT)、堿性磷酸酶(ALP或AKP)、尿素氮(BUN)、總蛋白(TP)、自蛋白(ALB)、血糖(GLU)、’總

5、膽紅素(TBIL)、肌酐(cR)、總膽固醇(TCHO)；病理檢查包括大體檢查和顯微鏡檢查。大體檢查要進行尸體解剖，解剖后取出心、肝、脾、肺、。腎、腎上腺、甲狀腺、胸腺、睪丸、子宮、腦和前列腺稱重，計算臟器系數(shù)。組織切片染色后在顯微鏡下檢查． 二、酸性肽小鼠肺腫瘤誘發(fā)實驗 本實驗設高、中、低劑量的三個實驗組和一個對照組，每組雌雄小鼠各40只。低劑量組給藥O．4g／kg／同。中劑量組給藥4g／kg／同。高劑量組給藥40g/k

6、g／同。對照組只給飲用水。給藥周期為32周，每周7天連續(xù)給藥。 觀測指標包括一般觀察和病理檢查：一般觀察內容主要包括外觀體征和行為活動；病理檢查包括尸體解剖和顯微鏡檢查。尸體解剖須細致檢查各組織和器官如心、肝、脾、肺、腎、腦、腎上腺、胰腺、胃、十二指腸、回腸、結腸、前列腺、淋巴結、膀胱、甲狀腺、胸腺、睪丸(連附睪)、子宮(及卵巢)等，若見腫塊應記錄發(fā)生部位、大小、質地、有無包膜、色澤，是否屬該動物品系自發(fā)性腫瘤、發(fā)生例數(shù)等。顯微

7、鏡檢查對象是各組小鼠的肺臟和各部位發(fā)現(xiàn)的腫塊。 結果： 一、酸性肽大鼠長期毒性實驗： L大鼠的外觀特征：兩組大鼠都是毛色白而光澤、耳色紅潤、活動自如、反應性好、飲食正常、尿糞正常、飲水進食及發(fā)育情況良好：沒有異常消瘦、體重增加的大鼠；處死前沒有大鼠死亡。 2．將兩組大鼠的各項血液學指標進行統(tǒng)計學對比處理發(fā)現(xiàn)：兩組大鼠的各項血液學指標沒有有統(tǒng)計意義的差別(P紅細胞>O．05；P血紅蛋白>0．05；P激血時間

8、>0．05；P白細胞>0．05；P嗜中性細胞>0．05；P嗜酸性細胞>0．05；P嗜堿性細胞>0．05；P淋巴細胞>0．05；P單核細胞>0．05；P血小板>0．05)。 3．將兩組大鼠的各項生化指標進行統(tǒng)計學對比處理發(fā)現(xiàn)：實驗組和對照組大鼠的各項生化指標之間沒有有統(tǒng)計意義的差別(P呲釉酶>0．05；P尿素氮>O．05；P肌酐>O．05：P糖>O．05；P膽固醇>0．05；P膽紅素>0．05；P谷丙轉氨酶>O．05；P谷革轉氨酶

9、>O．05；P總蛋白>0．05；P白蛋白>0．05)。 4．對兩組大鼠的臟器系數(shù)進行統(tǒng)計學對比處理發(fā)現(xiàn)：實驗組和對照組大鼠的各項臟器系數(shù)之間沒有有統(tǒng)計意義的差別(P心臟>0．05；P甲狀腺>O．05；P肝臟>0．05；P脾臟>O．05；P肺臟>0．05；P腎臟>O．05；P腎上腺>0。05；P腦>O．05；P睪丸>O。05；P前列腺>0．05)。 5．顯微鏡檢查：各實驗組及對照組大鼠心臟、甲狀腺、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、

10、腎上腺、腦、睪丸、前列腺、子宮、卵巢、胰腺、胃、十二指腸、回腸、結腸、垂體、脊髓、淋巴結、膀胱、胸腺、睪丸、附睪、視神經(jīng)等主要臟器大體及鏡下檢查均未見明顯病理變化。 二、酸性肽小鼠肺腫瘤誘發(fā)實驗： 1．一般觀察：給藥過程中多數(shù)小鼠表現(xiàn)正常，進食、飲水正常、尿糞正常、毛色順白而有光澤、活動自如、反應性好、生長發(fā)育良好。個別小鼠相互撕咬，有的小鼠受傷了，這種撕咬僅僅出現(xiàn)在各組雄鼠，各組雌鼠無咬傷現(xiàn)象，這可能與雄鼠好斗的生活習

11、性有關。實驗期間4例死亡，解剖說明小鼠均是死于炎癥或感染，死亡小鼠的分布一個在高劑量組，一個在中劑量組，兩個在對照組。小鼠的死亡和實驗藥物沒有關系。 2．大體解剖情況：小鼠處死后進行了解剖，仔細觀察心、肝、肺、腎、腦、淋巴結、胃、十二指腸、回腸、結腸、睪丸(連附睪)、子宮(及卵巢)等主要內臟器官。肉眼可見多數(shù)小鼠各臟器正常。摘除臟器后觀察胸腔、腹腔可見其內液體清亮、量少，無膿性、或顏色異常的積液。共在33只小鼠身上發(fā)現(xiàn)266個包

12、塊，這些包塊集中分布在肺、肝、皮下3處。這些腫塊的組別分布是：高劑量實驗組雄鼠4只，雌鼠3只，共7只；中劑量實驗組雄鼠3只，雌鼠4只，共7只；低劑量實驗組雄鼠5只，雌鼠5只，共10只；對照組雄鼠5只，雌鼠4只，共9只。統(tǒng)計學對比處理發(fā)現(xiàn)，包塊出現(xiàn)的頻率在各組之間沒有差別(P＞0．05)，它的出現(xiàn)頻率和給藥劑量高低也沒有關系。 3．顯微鏡檢查：對每個小鼠的肺和尸體解剖中發(fā)現(xiàn)的腫塊進行了病理切片檢查。顯微鏡檢查證實，在以上所檢出的腫

13、塊中，只有3個皮下腫塊是腫瘤，肝、肺所見腫塊是壞死組織。3個皮下腫塊確診為腺樣囊性癌。發(fā)生皮下腫瘤的小鼠中劑量實驗組雌鼠、低劑量實驗組雌鼠、對照組雌鼠各1只，統(tǒng)計結果說明各實驗組和對照組之間、各組和全體之間腫瘤發(fā)生率沒有有統(tǒng)計學意義的差別(P>0．05)。小鼠所發(fā)生的這幾個皮下腫瘤，和給藥與否、給藥劑量沒有關聯(lián)性。 結論： 1．酸性肽的長期應用并沒有對大鼠造成可以檢查出來的毒性影響。 2．在32周的實驗期內，實驗